郭啟勇，柳國鎖，黃海碧，吳心華*

(1. 寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750000；2. 金宇保靈生物藥品有限公司，內蒙古 呼和浩特 010000)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的一種傳染病[1-2]。BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員[3-4]。BVD病程復雜，臨床癥狀和亞臨床癥狀多樣，主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生產(chǎn)性能等機能破壞，并導致免疫抑制[5-6]。BVDV主要感染牛、綿羊、山羊、鹿等動物，多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染。新生犢牛經(jīng)常因為腹瀉而死亡[7-8]。牛病毒性腹瀉在臨床上經(jīng)常表現(xiàn)為混合感染，由于病毒感染后，導致牛群排毒造成持續(xù)性感染，臨床表現(xiàn)多樣，在不同的時期感染具有不同的臨床表現(xiàn)，懷孕母牛感染BVDV可以通過胎盤傳給胎兒[9-10]。BVDV感染牧場之后，由于防控困難。給牧場帶來極大的經(jīng)濟損失和資源浪費，世界上每年每頭牛損失50～500美元，平均大約46.5美元；歐洲的經(jīng)濟損失大概每年達到87美元[11-12]。中國目前為止沒有關于經(jīng)濟損失方面的研究和分析。BVDV 1946年在紐約州首次發(fā)現(xiàn)[13]，該病毒屬的病毒具有交叉感染性，豬的豬瘟病毒可以傳染給牛，牛的病毒性腹瀉可以傳染給豬、綿羊、山羊、駱駝、鹿、羚羊等[14-15]。

國外分為3個階段進行逐步凈化：第一個階段，加強牧場生物安全的防范措施，對周圍環(huán)境做定時、定期、定量的消毒，對引進的牛群嚴格按照OIE標準進行檢測，對于陽性牛立即淘汰，減少損失。做到安全隔離，禁止和牧場的接觸，預防出現(xiàn)持續(xù)性感染牛(PI)。第二階段有計劃有目標的嚴格篩查PI牛，篩查之后，應該盡快清除。第三階段，對健康牛進行檢測?？偨Y各國經(jīng)驗，清除PI牛是整個防控中最為嚴格和重要的一步。疫苗免疫雖然是提高牛的免疫力，但是無法阻止PI牛的出現(xiàn)和排毒。疫苗免疫有兩種形式存在，一種是篩查和淘汰，存在于奧地利、瑞士以及北歐的一些國家;另外一種就是免疫和淘汰，在養(yǎng)殖密集區(qū)域、疫病高發(fā)區(qū)域、動物流動率高的地區(qū)多進行疫苗免疫。

為了解BVD在規(guī)?；膛鲋械牧餍星闆r，采用ELISA檢測對奶牛養(yǎng)殖密集區(qū)域的銀川市、中衛(wèi)市、吳忠市、石嘴山市、固原市等規(guī)?；膛龅哪膛Ｑ鍢悠愤M行抗體檢測，對599份犢牛樣品采用熒光定量PCR進行病原檢測，為規(guī)?；膛龅姆揽毓ぷ魈峁?shù)據(jù)參考。同時選擇一個規(guī)?；翀鲎龇揽厥痉秷鲅芯浚瑸橐院蟊静〉姆揽靥峁嵺`經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 樣品

2018年9月到2019年6月，采集寧夏30個未進行疫苗免疫牧場的1 500份血樣，599份腹瀉犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子及死亡犢牛的脾臟組織樣品。

1.2 試劑

牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒和抗原快速檢測卡(美國愛德士公司)、AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)、Premix TaqTM(TaKaRa)、無酶水、無水乙醇等。

1.3 牛病毒性腹瀉的抗體檢測

嚴格按照愛德士ELISA抗體試劑盒說明書進行操作。

1.4 病料處理

在生物安全柜內處理。取大約5 mg的組織病料放置到2 mL帶有鋼珠的離心管中，用剪子盡可能剪碎。用組織研磨儀研磨裂解組織。加入PBS進行稀釋，取1 mL放入2 mL離心管中。編號，置于-20 ℃冰箱中。鼻拭子和肛拭子樣品在超凈工作臺中加入定量的PBS溶液，漩渦振蕩，吸取1 mL放入離心管中編號，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 病料的總DNA提取

采用TaKaRa MinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，提取病料組織中的總RNA。

1.4.2 熒光定量PCR

根據(jù)GenBank中登陸的BVDV的基因序列，利用DNAStar軟件MegAlign模板分析選擇Ⅰ型的5'UTR保守序列，引物由北京華大基因工程公司合成，探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物與探針

1.4.3 擴增體系

以已獲得的DNA為模板，加入RT-PCR buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，上下游引物(20 μmol/L) 各 1.0 μL，Ⅰ型1.0 μL，模板核酸 2 μL，加無酶水補充至 25 μL。擴增條件為：反轉錄 51 ℃ 15 min；94 ℃ 2 min；PCR 反應 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，45個循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后熒光定量PCR檢測方法的陰性對照無Ct值，BVDV陽性對照Ct值小于30，擴增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線。

結果判定標準：(1)陰性、陽性對照成立，R2>0.990，試驗成立。(2)結果判定：若被檢樣品出現(xiàn)S型擴增曲線，且Ct值為10～35，則結果為陽性；若3537，則判定為陰性。

1.5 防控方法

選擇寧夏吳忠的一個3 000頭規(guī)模未進行疫苗免疫的血清學陽性奶牛場，使用愛德士公司生產(chǎn)的BVDV抗原快速檢測卡進行檢測。無菌采集未斷奶犢牛耳組織，根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。

全群BVDV抗原檢測，成年母牛使用ELISA方法檢測，犢牛使用快速檢測卡檢測。陰性?；貧w群體，陽性牛隔離，21 d后重復送樣檢測，陰性?；貧w群體，陽性牛淘汰。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1 規(guī)?；膛隹贵w檢測

2.1.1 不同地區(qū)抗體檢測結果

對寧夏地區(qū)規(guī)?；膛龅? 500份進行了BVD抗體的檢測，結果見表2。共檢出1 314份陽性血清樣品，陽性率為87.6%。銀川市感染率最高為94.80%，固原市感染率最低為59.87%。

表2 寧夏地區(qū)不同地區(qū)血清抗體檢測陽性率

2.1.2 不同生長時期牛群的BVD抗體陽性率

根據(jù)奶牛的生長時期分為犢牛(0～6月齡)、青年牛(6～18月齡)和成年母牛(18月齡以上)。不同時期血清抗體檢查陽性率結果見表3。犢牛的血清抗體陽性率為83.33%，青年牛的血清抗體陽性率為84.08%，成母牛的血清抗體陽性率88.98%。

表3 不同生長時期血清抗體檢測陽性率

2.2 BVD病原檢測

從寧夏回族自治區(qū)規(guī)?；膛龀闃訜o菌采集599頭具有腹瀉癥狀犢牛的糞便、鼻拭子、肛拭子、脾組織樣品經(jīng)過處理后，用RT-PCR進行BVD病原檢測，結果見表4。顯示抗原陽性樣品數(shù)為16份，陽性率為2.67%，其中吳忠市的陽性率最高為4.42%，固原市未檢出陽性。

表4 不同地區(qū)的BVD抗原檢測結果

2.3 示范防控場BVD監(jiān)測

2019年8月對規(guī)模牧場300多頭未斷奶犢牛進行耳組織采集檢測，檢測結果發(fā)現(xiàn)陽性率為0.6%。PI牛的淘汰是規(guī)?；翀龇揽夭《拘愿篂a最好的防護方式，相對于接種疫苗預防而言，具有減少工作時間和減少經(jīng)濟支出的優(yōu)勢。2019年9月至11月對該牧場腹瀉死亡的病料進行熒光定量PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)陽性率為0，說明該牧場病毒性腹瀉的防控有效。

3 討論

改革開放以來，我國的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化，從原始的小農(nóng)戶生產(chǎn)變成了初具規(guī)模的農(nóng)牧公司生產(chǎn)。其中，奶牛養(yǎng)殖變化明顯，從以前小農(nóng)戶養(yǎng)殖變成了規(guī)模化、集約化的公司化養(yǎng)殖。由于我國原始品種不能充分滿足消費者的需求，因此大量從國外引種。貿易和集約化的養(yǎng)殖方式雖然提高了經(jīng)濟效益，但也加快了疾病傳播。牛病毒性腹瀉是一種以水平傳播為主的疾病，由于病毒特性，一旦在牧場存在便很難清除[16-18]。犢牛容易造成持續(xù)性感染，病牛初期沒有明顯的臨床癥狀，牧場獸醫(yī)很難通過臨床表現(xiàn)做出準確的診斷。病牛持續(xù)向牧場排毒，造成牧場的永久性污染。病毒性腹瀉在牧場盛行，極大地降低了犢牛的成活率。BVD導致牛淘汰之后，牧場的牛不能得到及時補充，存欄量下降，而且本病一旦進入牧場便長期存在。

本次試驗共檢測牛血清1 500份，其中血清抗體陽性的牛有1 314頭，抗體陽性率高達87.6%。其中犢牛抗體陽性率為83.33%，青年牛抗體陽性率為84.08%，成母牛抗體陽性率88.96%。對599份犢牛樣品應用熒光定量PCR進行病原檢測，其中陽性16份，陽性率為2.67%。1999年對西北地區(qū)牛病毒性腹瀉流行病學調查結果顯示，寧夏地區(qū)病毒性腹瀉血清抗體陽性55.95%[16]；2015年對寧夏地區(qū)病毒性腹瀉流行病學調查發(fā)現(xiàn)，血清抗體陽性率高達64.92%[17]；2016年對寧夏地區(qū)奶牛疑似病毒性腹瀉的牛采取了135份耳組織，進行抗原檢測，陽性率最高0.5%，平均0.01%[18]。說明我國規(guī)?；鯞VD感染嚴重，并且逐年呈上升趨勢，制定有效的防控措施迫在眉睫。

根據(jù)寧夏地區(qū)規(guī)?；膛鯞VD的流行情況來看，陽性率普遍較高。寧夏地區(qū)養(yǎng)牛在我國發(fā)展較早，國內外畜牧交易多，加之該地區(qū)全年干旱，對于奶牛和肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著得天獨厚的優(yōu)勢。未免疫牛群的血清陽性率存在著地區(qū)性的差異，說明牛群的生長環(huán)境也是導致牛感染病毒性腹瀉的原因之一。本次研究結果表明，清除PI 牛有助于牧場從根本上預防BVD的大規(guī)模感染。進行PI牛檢測之后，對PI陽性犢牛的姐姐、媽媽進行了跟蹤調查，結果發(fā)現(xiàn)犢牛的媽媽和姐姐抗原檢測陰性，抗體檢測陽性，說明犢牛的抵抗力相對較差，容易感染疾病，造成發(fā)病。關于相關傳播機制還需要進一步研究。本次的研究為以后BVD的防控提供成功經(jīng)驗，要想徹底預防本病，還需要從生物安全的方面考慮，盡量減少外來病原的侵入，堅持自繁自養(yǎng)。

綜上，從調查結果來看，規(guī)模化奶牛場病毒性腹瀉的感染率普遍較高，BVDV的感染導致免疫力下降，進而引發(fā)其他傳染病的發(fā)生，隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)的不斷集中，規(guī)模化、現(xiàn)代化牧場的不斷發(fā)展，疾病將會成為影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的決定因素。建立重大疾病預警體系，把疾病預防放在首位，是畜牧業(yè)發(fā)展的必然。從防控示范場的建設來看，清除PI牛是規(guī)?；翀鲎罱?jīng)濟的做法，也是減少規(guī)模化牧場疫病泛濫最為有效的方法。