田慧慧，孫君衛(wèi)，馬向飛，郭玉潔，李東華，孫桂榮，康相濤，閆峰賓

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002;2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在細(xì)胞液中，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)可以催化脂酰輔酶A與肉堿反應(yīng)生成脂?；鈮A，脂?；鈮A與載體結(jié)合以后會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，然后在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶2(carnitine palmitoyl transferase 2,CPT2)的作用下，脂?；鈮A又與輔酶A作用釋放出肉堿，重新生成脂酰輔酶A[1]。因此，CPT1是脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體的關(guān)鍵酶，也是脂肪酸β氧化的限速酶[2～4]。CPT1有不同基因編碼的3種亞型：肝型CPT1A、肌肉型CPT1B和大腦型CPT1C[5]。其中，CPT1A富集于肝臟中，在真核生物的脂肪酸代謝過(guò)程中，CPT1A是長(zhǎng)鏈脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移后進(jìn)行氧化以提供能量的關(guān)鍵限速酶[6]。在體外培養(yǎng)的棕色脂肪細(xì)胞中，CPT1A被證實(shí)能提高脂肪酸的β-氧化和線粒體功能[7]。CPT1A的功能主要是在機(jī)體或組織缺乏能量時(shí)，催化脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化，維持血糖和能量供給的平衡[8]；主要參與脂肪酸的β-氧化，與肝臟脂肪酸氧化、骨骼肌能量攝取以及棕色脂肪產(chǎn)熱供能有關(guān)[9]。不同組織中的CPT1A活性不同，在肝臟中活性最高，氧化速率也最高[10]。與CPT1B和CPT1C相比，CPT1A能更高程度地調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸的氧化過(guò)程，影響機(jī)體正常生命活動(dòng)，有著極其重要的作用[6]。

關(guān)于CPT1A的研究主要集中于哺乳動(dòng)物，在禽類上研究相對(duì)較少。前人主要研究了綿羊、山羊、小鼠和豬等動(dòng)物的CPT1A基因的生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)譜構(gòu)建，梁計(jì)峻等[5]指出CPT1A基因可能在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而禽類與哺乳動(dòng)物的能量代謝調(diào)節(jié)有著諸多差異[11]，所以在哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)論可能并不適用于禽類。

本文通過(guò)Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載CPT1A基因的氨基酸序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)CPT1A基因在同一周期固始雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝臟及不同周期胸肌中的表達(dá)水平，旨在分析該基因表達(dá)水平的組織和時(shí)空差異，為后續(xù)研究該基因的功能以及該基因分子機(jī)制和雞脂肪沉積提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物組織樣品的采集

分別選取6周、12周、22周和30周健康固始雞各3只，將雞放血處死以后，無(wú)菌采集12周固始雞胸肌、腹脂、皮脂、腿肌、肝組織，以及6周、12周、22周和30周固始雞胸肌組織，迅速投入液氮中進(jìn)行冷凍，之后置于-80 ℃保存以備使用。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TAKARA)、Trizol試劑(TAKARA)、氯仿、異丙醇和乙醇等。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ensembl.org/)查找并下載不同物種CPT1A基因的氨基酸序列；利用EXPASY在線工具中的ProtParam程序(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)雞CPT1A蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用EXPASY在線工具中的ProtScale程序(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析蛋白的特性；利用SignalP 4.1 Server程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SPOMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)和Phyre 2程序(https://sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白的結(jié)構(gòu)；利用SMART(http//:smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域、代謝通路并分析蛋白互作；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI所提供的雞CPT1A基因及內(nèi)參β-actin基因的序列，使用BLAST-Primer在線軟件來(lái)設(shè)計(jì)熒光定量PCR所需引物，引物設(shè)計(jì)完成后由尚亞生物公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 熒光定量引物信息

1.5 總RNA的提取

RNA提取使用Trizol法，具體操作步驟如下：取50 mg左右冷凍組織樣品于無(wú)RNA酶離心管中，加入1 mL的Trizol和2～3顆經(jīng)消毒的研磨鋼珠，混勻后放入全自動(dòng)樣品快速研磨儀中，50 Hz研磨90 s，重復(fù)3次后靜置5 min；加入200 μL氯仿并劇烈震蕩混勻，靜置至液體明顯分層，然后放入4 ℃離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為12 000 r/min,離心15 min；將上清液吸取到一個(gè)新的無(wú)RNA酶EP管中，加入相同體積的異丙醇，倒置混合后靜置10 min；放入4 ℃離心機(jī)，以12 000 r/min的速度離心15 min；棄去上清液體后加入1 mL現(xiàn)配的75%酒精，上下顛倒并洗滌管壁，再按上述條件離心15 min；倒掉酒精保留白色沉淀，打開(kāi)管蓋放置超凈工作臺(tái)風(fēng)干后，加入適量無(wú)RNA酶水，溶解沉淀，待沉淀完全溶解后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用1 %瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性，并使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量。

1.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行，試劑盒中包含著去除基因組污染的相關(guān)試劑。試驗(yàn)操作如下：取2 μL總RNA于離心管中，依次加入5 μL RNase Free dH2O、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer和1 μL gDNA Eraser，混勻并震蕩離心后使用PCR儀設(shè)置42 ℃反應(yīng)2 min；取上述反應(yīng)液，再加入4 μL RNase Free dH2O、4 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix1和1 μL RT Primer Mix, 混勻并震蕩離心后，將其放入PCR儀中，設(shè)置程序?yàn)?7 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。合成的cDNA用無(wú)RNA酶水稀釋后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以SYBR Green為染料，采用Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，該反應(yīng)平臺(tái)為L(zhǎng)ight Cycler?96 system系統(tǒng)，試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)由該系統(tǒng)配套軟件進(jìn)行收集和整理。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)操作簡(jiǎn)述如下：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，其中含有5 μL SYBR Green Mix，3 μL RNase Free dH2O，上、下游引物各0.5 μL和1 μL cDNA模板。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。72 ℃最終延伸10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用相對(duì)定量方法，以雞β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，目的基因CPT1A的相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt校正前-ΔCt校正后，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間顯著性差異分析使用單因素方差分析，選擇Duncan法檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。柱狀圖使用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞CPT1A蛋白理化特性分析

ProtParam程序預(yù)測(cè)顯示，雞CPT1A蛋白分子式為C3971H6136N1058O1131S34，氨基酸的數(shù)量為770個(gè)，分子量為87 784 Da，理論等電點(diǎn)為8.62。其氨基酸組成中，丙氨酸所占比例最高為6.6 %(51個(gè)氨基酸)，帶負(fù)電荷的氨基酸總數(shù)為85個(gè)(天冬氨酸+谷氨酸)，帶正電荷的氨基酸總數(shù)為92個(gè)(精氨酸+賴氨酸)。不穩(wěn)定指數(shù)為39.25，說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白。脂肪系數(shù)為82.15，總平均親水性為-0.297。利用ProtScale程序在線分析雞CPT1A蛋白特性，結(jié)果見(jiàn)圖1A。標(biāo)度值<0的區(qū)域比標(biāo)度值>0的區(qū)域密集(標(biāo)度值<0值表示親水性，標(biāo)度值>0值表示疏水性)，結(jié)合上述總平均親水性為-0.297，所以可推斷該蛋白屬于親水性蛋白。Signal P 4.1程序預(yù)測(cè)顯示該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。經(jīng)TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖1B。雞CPT1A蛋白有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于雞CPT1A蛋白氨基酸序列的62到84位和104到126位，因此可知該蛋白是跨膜蛋白。

圖1 雞CPT1A蛋白親/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.2 雞CPT1A蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

SPOMA預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2A。雞CPT1A蛋白主要是由α-螺旋(49.48%)，β-折疊(5.19 %)，延伸鏈(11.56 %)和無(wú)規(guī)則卷曲(33.77 %)組成。通過(guò)Phyre 2預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖2B。

圖2 雞CPT1A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.3 雞CPT1A蛋白功能結(jié)構(gòu)域、蛋白互作以及代謝通路預(yù)測(cè)分析

SMART分析雞CPT1A蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖3A。該蛋白在1～47和171～759氨基酸殘基處存在兩個(gè)保守性結(jié)構(gòu)域。

蛋白互作圖見(jiàn)圖3B。雞CPT1A蛋白可能與長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶家族(ACSLs)、長(zhǎng)鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族(ACSBGs)、CPT2以及脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)存在相互作用；預(yù)測(cè)顯示該蛋白可能參與的代謝通路為脂肪酸代謝，PPAR信號(hào)通路和脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路。

圖3 雞CPT1A蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析和蛋白互作分析

2.4 CPT1A基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

選取了奶牛、山羊、豬、人、小鼠、雞和斑馬魚(yú)共7種典型動(dòng)物，用Clustal W對(duì)下載好的各個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用MEGA 6.0軟件，采用NJ(Neighbor-joining)法自晨分析(Bootstrap)1 000次，構(gòu)建不同物種CPT1A基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。雞與斑馬魚(yú)CPT1A基因的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與小鼠、人、豬、山羊、奶牛的親緣關(guān)系較近。

圖4 CPT1A基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.5 CPT1A基因在12周固始雞不同組織中的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)CPT1A基因在12周固始雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌、肝臟共5個(gè)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。CPT1A基因在12周固始雞的5個(gè)組織中均有表達(dá)，在肝臟中表達(dá)水平最高，且顯著高于其余4個(gè)組織(P<0.05)。在胸肌和腿肌中表達(dá)水平次之，在腹脂和皮脂中表達(dá)量較低，且在這4個(gè)組織中表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.6 CPT1A基因在不同時(shí)期發(fā)育階段固始雞胸肌中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來(lái)分析CPT1A基因在固始雞胸肌中的表達(dá)情況。由圖6可知，CPT1A基因的表達(dá)水平在不同時(shí)期發(fā)育階段固始雞的胸肌中存在一定差異。CPT1A基因在12周和6周固始雞的胸肌中表達(dá)量相對(duì)較高，30周則表達(dá)量最低，且6周和12周表達(dá)水平顯著高于22周和30周表達(dá)水平(P<0.05)。

圖6 CPT1A基因在不同時(shí)期固始雞胸肌中的差異表達(dá)

3 討論

CPT1A基因主要定位于線粒體外膜,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞漿中的游離脂肪酸至線粒體內(nèi),進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸后續(xù)的酸氧化[12]，是真核生物體內(nèi)脂肪酸β-氧化的限速酶，對(duì)機(jī)體的脂肪代謝調(diào)控具有重要作用[13]。Bruce等[14]發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)CPT1A活性或提高CPT1A表達(dá)量均可促進(jìn)脂肪酸β-氧化。一項(xiàng)在肥胖小鼠及瘦鼠的體內(nèi)試驗(yàn)也表明，CPT1A表達(dá)增加可降低肝臟甘油三酯的含量[15]，因此可以通過(guò)提高該基因的表達(dá)來(lái)加快脂肪酸氧化，進(jìn)而改善代謝紊亂，及時(shí)進(jìn)行能量補(bǔ)給，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝平衡[9]。越來(lái)越多的研究證明，CPT1A基因?qū)τ趧?dòng)物機(jī)體的能量代謝和脂肪沉積發(fā)揮著重要作用，對(duì)于該基因的研究主要集中在哺乳動(dòng)物上，在禽類上研究相對(duì)較少。

通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因的序列進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：雞CPT1A蛋白為穩(wěn)定性蛋白，親水性強(qiáng)，無(wú)信號(hào)肽，有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于跨膜蛋白，有兩個(gè)保守性結(jié)構(gòu)域，與長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶家族(ACSLs)、長(zhǎng)鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族(ACSBGs)、CPT2以及脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)存在相互作用，該預(yù)測(cè)結(jié)果與梁計(jì)峻[5]在山羊上的預(yù)測(cè)結(jié)果較一致。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來(lái)分析該基因在雞各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CPT1A基因在雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝中均有表達(dá)，可以得知該基因在雞體內(nèi)廣泛表達(dá)，且組織表達(dá)模式存在差異，該結(jié)果與他人在羊上的研究結(jié)果較一致[1,16]。豬上的研究也表明，該基因在多種組織中均有表達(dá)，是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因，且在肝臟中表達(dá)量最高[17]。該基因在肝臟中表達(dá)量最高可能是因?yàn)槿鈮A主要在肝臟中合成，所以該基因作為肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)基因在肝臟中高表達(dá)。

本研究還分析了CPT1A基因在不同周齡固始雞胸肌中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在不同發(fā)育階段固始雞的胸肌中，CPT1A基因呈現(xiàn)出不同的表達(dá)量，12周和6周表達(dá)量相對(duì)較高，其次是22周，30周表達(dá)量則最低，不同時(shí)期該基因的差異表達(dá)可能是因?yàn)闄C(jī)體在不同時(shí)期脂代謝能力有所差異。Bartelds等[18]發(fā)現(xiàn)，CPT1A基因在羔羊出生后表達(dá)量有所增加，可能是因?yàn)樵摶虻谋磉_(dá)與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究CPT1A基因在分化過(guò)程中不同階段的功能。任陽(yáng)等[19]在檢測(cè)金華豬與長(zhǎng)白豬CPT1基因mRNA的組織分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)品種間也存在差異現(xiàn)象，本文后期打算進(jìn)行品種間的差異檢測(cè)。該基因在雞不同組織中、不同時(shí)期胸肌中的表達(dá)存在差異的機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。有研究表明CPT1A基因與雞的胸肌脂肪酸氧化相關(guān)，并影響肌內(nèi)脂肪的含量[20]，其表達(dá)水平與體脂肪的含量有關(guān)[21]。本研究表明雞CPT1A基因具有組織和時(shí)空差異性，該試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能以及該基因與雞脂肪沉積、生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系提供了一定的理論基礎(chǔ)。