魏其，屈勇剛*，常軍帥，谷思穎，吳圓圓，于會舉，李靜，張家瑞，肖陳城*，李巖

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆 烏魯木齊 830063)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea,BVD)又稱牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染引起的一種接觸性傳染病，可造成牛感染嚴重的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病及免疫抑制等[1-3]。Olafson等[4]在美國首次報道BVDV在牛腸道及排泄物中被檢測出，并稱該病的典型特征為腹瀉。1953年，美國衣阿華州在感染牛首次檢測到BVDV，該病牛的主要臨床表現(xiàn)為胃腸道黏膜潰瘍[5]。隨后該病在多個國家和地區(qū)廣泛流行，對牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重威脅。1980年李佑民等[6]首次在我國患病母牛及流產(chǎn)胎兒中檢測到BVDV的存在，并分離到了一株BVDV的野毒株。隨后在我國多個省份和地區(qū)陸續(xù)檢測出BVDV的存在，青海、寧夏、新疆的流行病學(xué)研究表明西北地區(qū)牛群中存在很高的BVDV抗體陽性率[7-9]。

BVDV是一種單股正鏈RNA病毒，其整個基因組由3′UTR、ORF編碼區(qū)和5′UTR共同組成的一個大的開放閱讀框，能編碼所有的病毒蛋白。根據(jù)抗原性的不同和5′UTR的高度保守性，BVDV可分為2種基因型BVDV1和BVDV2。近年來，巴西、歐洲等發(fā)現(xiàn)BVDV3 型，但我國沒有BVDV3型感染牛的相關(guān)報道[10]。我國2005至2013年主要分離鑒定出BVDV1型324株，其中BVDV1b和BVDV1m亞型毒株最多；鑒定出BVDV2型3株，主要為BVDV2a和2b亞型[11]。王夢心等[12]對在黑龍江省采集50份陽性病料進行BVDV分型發(fā)現(xiàn)所有毒株均屬于BVDV1型，其中BVDV1b亞型占比最高為50.00%。隨后馬振國等[13]對新疆地區(qū)牛群進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均抗體陽性率為52.03%，抗原陽性率高達70.00%，主要流行的毒株基因型是BVDV-1q。BVDV在我國多個省份或地區(qū)已普遍存在，其中BVDV1型毒株最為流行，且在新疆地區(qū)的感染程度也相當(dāng)嚴重。因此為了調(diào)查BVDV對新疆地區(qū)牛群的感染情況，本研究應(yīng)用RT-PCR的方法對采自新疆部分地區(qū)的640份牛全血樣品進行BVDV的檢測及基因分析，以了解新疆地區(qū)BVDV的流行現(xiàn)狀及主要流行毒株，進一步為新疆地區(qū)牛BVD的防控措施及凈化工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采集于2019年新疆具有代表性的13個地區(qū)(阿克蘇、巴州、喀什、伊犁、石河子、昌吉、阿勒泰、博州、塔城、哈密、和田、奎屯、烏魯木齊)的規(guī)?；ｐB(yǎng)殖場，石河子地區(qū)采集樣品160份，其余各地區(qū)采集樣品均為40份，共采集牛全血640份，其中有120份樣品采自石河子地區(qū)某規(guī)?；膛霾煌挲g段的牛群，于-80 ℃溫度下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、Trans1-T1感受態(tài)細胞、TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(購自寶生物工程大連有限公司)，F(xiàn)astPure Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Taq Plus Master Mix、DL-2 000 Marker(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.3 病毒總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取200 μL的病毒血液，參照TAKARA DNA/總RNA提試劑盒說明書提取病毒基因組總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：總RNA 4 μL為模板，加入RNase-free Water 12 μL混勻后，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min后，加入5×TransScript?All-in-One SuperMix for PCR 4 μL，42 ℃孵育30 min，85 ℃熱激5 s，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物合成與檢測

根據(jù)參考文獻[10]合成BVDV-F/BVDV-R，引物由華大基因合成，引物序列及片段長度如表1，送至華大基因進行測序拼接，其擴增目的片段大小為288 bp。對采集樣品進行檢測，PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物7 μL經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將相應(yīng)大小條帶的膠切下，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit進行膠回收純化，按照說明書操作，回收產(chǎn)物于-20 ℃保存，備用。

表1 BVDV引物序列及擴增片段大小

1.5 PCR回收產(chǎn)物的克隆及測序分析

將PCR的回收產(chǎn)物按照pEASY-T1 Simpie Cloning Kit說明書連接到T載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，挑取單個菌落搖菌并進行PCR鑒定，反應(yīng)體系及條件同RT-PCR方法。對鑒定結(jié)果為陽性的菌液送北京睿博興科生物有限公司進行測序。使用DNAMan、MegAlign和MEGA 6.06軟件進行序列分析，序列比對用clustal W算法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用neighbor-joining方法。與國內(nèi)外BVDV序列比對，所有參照序列的BVDV基因組從NCBI基因庫下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV目的基因RT-PCR擴增

對采集的13個地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)牛場640份牛全血樣品進行基因檢測，凝膠電泳結(jié)果表明，陽性條帶大小與預(yù)期目的片段大小一致(288 bp)，結(jié)果見圖1。

M.DL2000 DNA Marker；1～8. 牛全血樣品；N.陰性對照；P.陽性對照

此次研究共檢測出BVDV陽性樣品256份，平均總陽性率為40.0%(256/640)。各地區(qū)均檢測到BVDV的存在，檢出率為22.5%～62.5%；奎屯地區(qū)最高，為62.5%；喀什地區(qū)與博州地區(qū)最低，均為22.5%。檢測結(jié)果見表2。

表2 不同地區(qū)BVDV檢測結(jié)果統(tǒng)計表

不同年齡段牛群感染BVDV的平均陽性率為22.5%(27/120)，其中經(jīng)產(chǎn)母牛的陽性率最高，為50.0%(6/12)，5月齡與6月齡牛未檢出陽性，均為0.0%(0/12)，如表3。

表3 不同年齡段牛BVDV檢測結(jié)果

2.2 BVDV 序列的測定與分析

測序結(jié)果表明，樣品基因片段大小為288 bp。運用DNAMan、MegAlign軟件和NCBI,將本研究得到的5株BVDV核苷酸序列與國內(nèi)外17株BVDV基因序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)獲得的5株BVDV核苷酸序列之間有較高的同源性為98.3%～99.7%，其中ChangJ-12和KT-02同源性最高為99.7%；SHZ-06和ALT-05同源性最低為98.3%。與國內(nèi)外BVDV1型毒株的同源性78.6%～98.2%，其中與中國毒株BVDV1a亞型的同源性最高為98.2%，與中國毒株BVDV1u亞型的同源性最低為78.6%；與國內(nèi)BVDV2型毒株的同源性77.1%～77.4%；與國外BVDV3型毒株的同源性71.2%～74.3%，見圖2。

圖2 BVDV核苷酸序列的同源性分析

運用 MEGA 6.0軟件將本研究所獲得的5株BVDV基因核苷酸序列與國內(nèi)外17株BVDV基因序列共同建立遺傳進化樹，見圖3。根據(jù)遺傳演化分析可知，本研究獲得的ChangJ-12、KT-02、SHZ-06、ALT-05、AKS-2處在同一分支，與中國株BVDV1a亞型歸為同一簇，遺傳關(guān)系較為接近，但與BVDV2型、BVDV3型的遺傳關(guān)系較遠。

注：●為本研究所獲得的BVDV核苷酸序列

3 討論

BVD可使動物發(fā)生免疫抑制，免疫抑制和持續(xù)性感染是疫病長期傳播的主要原因，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[14]，因此篩選BVDV陽性?？滩蝗菥?。BVDV檢測方法有病毒分離、RT-PCR、免疫熒光技術(shù)和核酸雜交技術(shù)等[15]。劉崇向等[16]首次在新疆檢測到BVDV的存在，通過免疫電泳和瓊擴反應(yīng)進行檢測，抗體陽性率高達79.50%。隨后在新疆其他地區(qū)也陸續(xù)檢測出BVDV的存在，如王青青等[17]在2015至2016年新疆南疆地區(qū)30份疑似的樣品中檢測出2份陽性樣品，陽性感染率為6.67%。王競晗等[18]對2014年購買的一批進口胎牛血清，進行BVDV的分離及鑒定，得到一株BVDV 1a亞型病毒，說明市場上的牛血清有部分存在 BVDV污染。

本研究采用RT-PCR的方法對選取新疆具有代表性的13個地區(qū)的牛養(yǎng)殖場，共640份牛全血進行BVD流行狀況調(diào)查，在13個地區(qū)均檢測出BVDV陽性樣品，平均陽性率為40.0%(256/640)，各地區(qū)檢出率為22.5%～62.5%，其中奎屯地區(qū)最高，為62.5%，喀什地區(qū)與博州地區(qū)最低，均為22.5%，表明BVDV已在新疆廣泛存在。BVDV極易通過排毒期病牛的尿液、口鼻分泌物、排泄物或羊膜液污染飼料等進行擴散，污染物使病毒能夠間接地從動物向動物、從畜群向畜群傳播。胎兒的感染由母體的垂直傳播以及帶毒的精液導(dǎo)致[19]。本研究在不同年齡段的經(jīng)產(chǎn)母牛與10日齡犢牛中均檢測出BVDV，但未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，其中經(jīng)產(chǎn)母牛與10日齡牛之間為一一對應(yīng)關(guān)系，反映了BVDV存在的垂直傳播方式，這與前人研究具有相似性。從不同生長階段可以看出，在一歲、兩歲和經(jīng)產(chǎn)牛中該病毒的陽性感染率呈上升趨勢，推測因配種等外界原因加大了感染該病毒的可能性，但因本研究采集的樣本有限，為證實這一點還需進一步研究。

本研究得到的5株BVDV核苷酸序列，與國內(nèi)外BVDV1型毒株的同源性78.6%～98.2%，其中與中國毒株BVDV1a亞型的同源性最高為98.2%；與國內(nèi)BVDV2型毒株的同源性77.1%～77.4%；與國外BVDV3型毒株的同源性71.2%～74.3%。通過建立遺傳進化樹，對遺傳進化分析可知，本研究獲得的毒株處在同一分支，與中國株BVDV1a亞型歸為同一簇，遺傳關(guān)系較為接近，但與BVDV2型、BVDV3型的遺傳關(guān)系較遠。