鐘池，李鑫，舒展，陳卓，馮雷喜、馬義誠，趙紅瓊，郝智慧，姚剛*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆阿勒泰地區(qū)動物疾控中心，新疆 阿勒泰 836500；3. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，北京 100000)

家畜寄生蟲病是危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要疾病。家畜寄生蟲病在防治上主要采用藥浴、投喂驅(qū)蟲藥、體表澆潑、注射等方式驅(qū)除體內(nèi)外寄生蟲[1]。伊維菌素是一種廣譜、高效、低毒的抗寄生蟲藥物，對體內(nèi)線蟲和體外節(jié)肢動物均有驅(qū)蟲活性，現(xiàn)已開發(fā)出多種獸醫(yī)臨床使用的制劑產(chǎn)品如注射劑、澆潑劑等，并廣泛用于防治多種動物的線蟲病和節(jié)肢動物寄生蟲病[2-3]。

人類和動物機體的腸道菌群(gut microbiota)與其宿主的健康關系密切，腸道菌群通過影響宿主的生長發(fā)育、生理功能、免疫和行為等來改變宿主的健康[4]。已有研究報道證明，寄生蟲等環(huán)境因素可影響宿主的腸道菌群組成和結構，反之亦然[5]。Knutie[6]對寄生飛絨蠅(Philornisdownsi)的加拉帕戈斯嘲鶇(Galapagosmockingbirds)和達爾文雀(Darwin’sfinches)雛鳥腸道菌群組成結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)飛絨蠅的寄生降低了加拉帕戈斯嘲鶇雛鳥的腸道菌群的生境內(nèi)多樣性。給新生工蜂感染Lotmariapassim原蟲后導致其腸道核心菌群組成發(fā)育不全[7]。Gilchrist等[8]研究發(fā)現(xiàn)，人體溶組織菌阿米巴(Entamoebiasishistolytica)感染后，腹瀉癥狀的發(fā)生與寄生蟲侵害加重和糞普氏菌(Prevotellacopri)的增加有關[8]。被線蟲感染的兔和被鞭蟲感染的小鼠，在感染急性期的腸道菌群 Alpha 多樣性顯著減少[9-11]。在靈長動物中，腸道寄生蟲(線蟲和美洲鉤蟲)的自然或?qū)嶒炐愿腥臼鼓c道菌群的 Alpha 多樣性普遍增加[12-14]。但郭歆巖[15]研究表明，腸道菌群的 Alpha 多樣性在寄生蟲感染后沒有改變。因此，腸道內(nèi)寄生蟲和與之共生的龐大腸道菌群可能有著錯綜復雜的關系，值得深入研究。對不同驅(qū)蟲劑型作用下，腸道菌群結構是否會發(fā)生改變尚未有明確報道。本試驗采用伊維菌素澆潑劑和注射劑作為驅(qū)蟲藥，使用澆潑和注射兩種驅(qū)蟲方式對綿羊進行的驅(qū)蟲效果試驗，同時對兩種驅(qū)蟲方式作用下的腸道菌群結構的變化進行研究，探索兩種伊維菌素劑型是否會對腸道菌群結構有影響，也籍此對兩種伊維菌素驅(qū)蟲劑的安全性提供胃腸功能方面的間接支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

取自阿勒泰地區(qū)某肉羊養(yǎng)殖合作社放牧加補飼的健康母羊75只，年齡為4～5歲，體重為(50.96±7.27)kg。

1.2 藥品與試劑

0.5%伊維菌素澆潑劑，1 mL含伊維菌素5 mg，每瓶 200 mL裝，中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供。主要成分為伊維菌素，藥物批號為20191216。

1%伊維菌素注射劑，1 mL含伊維菌素10 mg，每瓶200 mL裝，中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供，藥物批號為20191220。

糞便DNA提取試劑盒(Stool Genomic DNA Kit，50 preps)，貨號CW2092，生產(chǎn)日期為2018年9月，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 試驗設計與分組處理

通過篩選的阿勒泰大尾羊75只，隨機分為3組，注射驅(qū)蟲組、澆潑驅(qū)蟲組和不驅(qū)蟲對照組，每組25只。不驅(qū)蟲對照組(Ctr)不進行用藥；注射驅(qū)蟲組(Inj)劑量按 0.02 mL/kg，皮下一次注射給藥；澆潑驅(qū)蟲組(Spi)劑量按 0.1 mL/kg，羊背部澆潑一次給藥。分別于用藥前(第0天)和用藥后(第21天)觀察檢查體表寄生蟲，測定羊體溫、呼吸、脈搏等生命體征，并采集糞便。糞便采集2份，分別用于觀察體內(nèi)蟲卵(低溫保存)和高通量測序(采集的糞便液氮速凍帶回實驗室保存)。

1.4 指標測定

1.4.1 生理指標測定

體溫測定：采用電子數(shù)字溫度計將溫度計置于羊后肢股內(nèi)側并讀數(shù)，或者獸用紅外測溫儀測量，獸用紅外線測溫儀測定羊的體溫3～5 s，測3次取平均值；

呼吸測定：通過觀察羊胸腹部的起伏動作測定，秒表記錄每分鐘呼吸次數(shù)；

脈搏測定：通過觸壓后肢股內(nèi)側部股動脈，秒表記錄每分鐘脈次數(shù)。

呼吸、脈搏秒表計數(shù)15 s，測定3次，取平均值，算出每分鐘呼吸、脈搏數(shù)。

1.4.2 體表寄生蟲檢查

疥螨、癢螨和蜱蟲的采樣方法參照文獻[16]進行采集，檢查方法參照文獻[17]進行。虱子的采樣和檢查鑒定方法參照文獻[18]進行。

1.4.3 體內(nèi)線蟲卵檢查

采用麥克馬斯特氏法進行蟲卵計數(shù)。按照楊希菊[19]的方法制備飽和鹽水 (100 mL水加食鹽 35～40 g) 1 L于錐形瓶中，從糞便不同的部位挑起 2 g的糞便塊，加入飽和鹽水 58 mL，將糞便充分震蕩搗碎，與鹽水攪勻，使成均勻糞液[19]。用吸管吸取糞汁注入麥氏計數(shù)室中，靜置 1～2 min，然后再鏡下計數(shù) 1 cm2方格內(nèi)的蟲卵總數(shù)，求出兩個刻度室中的蟲卵平均數(shù)，乘以200即為每克糞便蟲卵數(shù)(EPG)。

1.4.4 腸道菌群結構分析

用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中DNA，操作步驟按照說明書和文獻[20]等所述方法進行。

采用16S rDNA序列擴增、測序、分析。測序分析由深圳微生太科技有限公司完成。按照流程操作準備樣品，提取糞便DNA，然后進行PCR擴增。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設計相應引物，并在添加測序時區(qū)分不同樣本的標簽序列(Barcode)，進而對rRNA基因可變區(qū)(單個或連續(xù)的多個)或特定基因片段進行PCR擴增。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。最后上機進行高通量測序，由于MiSeq測序讀長較短的特性，同時也為了保證測序質(zhì)量，設定目標片段的測序長度為 200～450 bp。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對腸道菌群物種操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)進行豐度、維恩(Venn)圖、Alpha多樣性、Beta多樣性等分析。所測數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism 8.0.1進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 體內(nèi)外驅(qū)蟲情況

在驅(qū)蟲第0天和驅(qū)蟲第21天，對各試驗組羊體表寄生蟲和體內(nèi)蟲卵統(tǒng)計計數(shù)。結果表明，經(jīng)注射、澆潑方式驅(qū)蟲后對體內(nèi)線蟲卵、體外寄生蟲總數(shù)較驅(qū)蟲前具有極顯著差異(P<0.01)，驅(qū)蟲效果明顯(表1)。

表1 各試驗組羊在使用藥物前后體外寄生蟲總數(shù)和體內(nèi)蟲卵情況統(tǒng)計

2.2 生理指標測定結果

對各試驗組羊的體溫、呼吸和脈博次數(shù)測定結果如表2所示。2個驅(qū)蟲組與對照組間體溫、呼吸和脈搏數(shù)值均無顯著差異(P>0.05)。

表2 各試驗組羊生命體征測定結果

2.3 腸道菌群測定結果

2.3.1 腸道微生物物種組成分析

2.3.1.1 腸道菌群OTU組成Venn分析

基于腸道菌群物種操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)進行Venn法初步分析，結果如圖1所示。Ctr、Inj和Spi 3組共有的OTU為42個，Ctr組特有OTU為517個，Inj組特有OTU為561個，Spi組特有OTU為655個(圖1)。

圖1 各組羊腸道微生物共有OTUs的數(shù)量Venn圖

2.3.1.2 差異物種Lefse分析

根據(jù)差異物種Lefse分析，結果發(fā)現(xiàn)梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)為Ctr組綿羊腸道菌群的差異表達特征菌屬。Ctr組中該菌屬平均相對豐度為0.01%，而經(jīng)Inj和Spi方法驅(qū)蟲處理后，腸道菌群中沒有檢測到梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌屬(Clostridium)的菌屬存在(圖2)。LDA值分布柱狀圖(顯著差異物種影響程度)顯示出梭菌科、梭菌屬為Ctr組的差異物種。

圖2 LEfSe分析進化分支圖和差異物種影響

2.3.1.3 門和屬水平菌群豐度及物種組成

在3個試驗組羊的腸道菌群門水平上，共檢出15個菌門，如圖3A所示。相對豐度大于等于0.1% 的菌門有8個，這8個門水平的細菌是這3個組羊中的核心菌群。相對豐度大于等于10% 的菌門有2個，它們分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，是這3個組羊的優(yōu)勢菌群。將2個驅(qū)蟲組與不驅(qū)蟲的對照組比較，結果見表3。3個試驗組門水平OTU相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

注：未譯中文的英文菌名，暫無合適中文譯名

表3 各組羊腸道菌群中相對豐度最高的15個門

在腸道菌群屬水平上，共檢出92個菌屬，并對前20的菌屬(共包含了90% 以上的相對豐度)進行了統(tǒng)計制圖(圖3B)。在圖3B中大于10% 的2個菌屬分別為疣微菌科未明確分類的屬(Unspecified_Ruminococcaceae)和擬桿菌目未明確分類的屬(Unspecified_Bacteroidales)，它們是3個試驗組羊的優(yōu)勢菌群。將不同驅(qū)蟲方式的2個組與不驅(qū)蟲對照組比較，結果顯示(表4)，屬水平OTU相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組羊腸道菌群中相對豐度最高的20個屬

2.3.2 Alpha多樣性分析

如表5所示，注射驅(qū)蟲組、澆潑驅(qū)蟲組觀測到的群落豐富度指數(shù)(Chao1)、群落多樣性指數(shù)(Shannon)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(Faith’s_pd)，均無顯著差異(P>0.05)。

表5 Alpha多樣性指數(shù)分析

2.3.3 Beta多樣性

通過不同樣品間的微生物群落構成進行比較，主坐標分析(PCoA)顯示，不同驅(qū)蟲模式下的樣品聚集在一起，微生物群落結構相似度高(圖4A)。非度量多維尺度分析(NMDS)中樣本間距離與主坐標分析結果類似，微生物群落結構相似度高(圖4B)。Permanova檢驗分析表明(表6)，不同驅(qū)蟲模式作用下菌群結構無顯著差(P>0.05)。

注：括號中百分比表示對應坐標軸所解釋的樣本差異數(shù)據(jù)比例

表6 Permanova檢驗

3 討論

本次驅(qū)蟲試驗采用了伊維菌素注射和澆潑兩種驅(qū)蟲方式，均對綿羊的體外寄生蟲驅(qū)蟲效果明顯。消化道蟲卵檢測結果也表明，兩種方式對體內(nèi)寄生蟲蟲卵數(shù)也有一定的驅(qū)除作用。本試驗與王文龍等[21]的澆潑、注射方法一樣，結果也一致；同時與魏彩艷[22]伊維菌素澆潑結果也一致。

人和動物的腸道內(nèi)有數(shù)以萬計的微生物，包括細菌、古生菌、病毒和真菌等，其中數(shù)量最多的是細菌。這些微生物與宿主共代謝、共進化，形成互惠共利的復雜關系。腸道菌群能為機體提供營養(yǎng)和能量、調(diào)節(jié)免疫、頡抗病原微生物、參與代謝，甚至能影響宿主的行為[23-24]。機體的腸道菌群受遺傳因素、飲食和環(huán)境(如使用驅(qū)蟲藥)等多因素的影響。這種共生關系可能會因為疾病而被破壞，諸如寄生蟲感染能夠影響宿主腸道菌群組成，進而影響宿主健康；而腸道菌群也能夠影響寄生蟲的活力與感染力[25]。有研究表明在腸道微生物與寄生蟲相互作用，腸道菌群的穩(wěn)定是宿主健康的關鍵因素之一[26]。Coyte等[27]發(fā)現(xiàn)，蛔蟲的感染會對宿主造成嚴重的營養(yǎng)不良，損害了宿主的認知、記憶等功能，同時也引起腸道菌群發(fā)生變化，與感染寄生蟲的糞樣相比較，未感染寄生蟲的糞樣顯示出腸道菌群物種的豐度更高。寄生蟲和腸道菌群間的作用是相互的，通過改變腸道菌群的組成可能增加黏膜部位對寄生蟲感染的抵抗力，并提升宿主對這些寄生蟲的全身免疫能力[28]。分析人類感染寄生蟲過程中腸道微生物的特定成分中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌(Bifidobacterium)和鏈球菌(Streptococcus)豐度較高的宿主對惡性瘧原蟲的抗感染能力更高[29]。在胃腸道寄生蟲入侵后，急性發(fā)作的炎癥是伴隨著初始腸道菌群Alpha多樣性減少，并且隨著慢性感染的建立而恢復[30-31]。

目前研究表明，抗生素藥物大量應用于多種疾病的治療，同時可能會導致腸道微生物群生態(tài)失調(diào)，多樣性發(fā)生改變等[32]。試驗證實小鼠飼喂萬古霉素、新霉素等抗生素后腸道菌群結構發(fā)生改變，多樣性指數(shù)(Chao 1，Shannon，Simpson)均顯著下降[33]。本試驗腸道菌群測定結果表明，經(jīng)兩種驅(qū)蟲方法處理后，綿羊腸道菌群結構整體沒有被影響，不同驅(qū)蟲方式屬水平OTU相對豐度無顯著差異，Alpha多樣性分析顯示均無顯著差異，Beta多樣性分析顯示，不同驅(qū)蟲模式作用下菌群結構無顯著差異。這可能與本文試驗所用藥物與前述研究不同、給藥方式不同和用藥濃度較低，澆潑和注射給藥并未直接接觸動物消化道等因素有關。另外，鄭舟琴等[34]在分析抗生素對小鼠糖代謝及腸道菌群的影響試驗中，每周對小鼠糞便做16S rDNA基因測序分析，發(fā)現(xiàn)抗生素組較對照組腸道菌群Shannon指數(shù)顯著下降。萬有娣等[33]在試驗中發(fā)現(xiàn)，其中一組感染第9天時，小鼠腸道菌群和微生物代謝已基本恢復。而本試驗結果的觀察測定時間為驅(qū)蟲后第21天，顯著長于上述文獻的第9天，也可能是未發(fā)現(xiàn)腸道菌群結構顯著變化的另一個原因。

梭菌屬是一群革蘭陽性菌，能產(chǎn)生芽胞，對外界抵抗力強。其廣泛分布于環(huán)境、人和動物腸道中，該屬中有許多種可產(chǎn)生外毒素的致病菌，對人和動物產(chǎn)生危害，其常見致病厭氧芽胞梭菌主要有破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌(Clostridiumdifficile)等。研究表明，纖維攝入量過低均可能形成有利于梭狀芽胞桿菌生長的腸道環(huán)境，從而增加梭狀芽孢桿菌感染導致結直腸癌發(fā)生的風險[35-36]。調(diào)節(jié)腸道的微生物群的平衡，可以抑制梭狀芽孢桿菌的生長，從而達到降低結直腸癌風險[37]。本試驗根據(jù)物種差異Lefse分析發(fā)現(xiàn)，梭菌科和梭狀屬為不驅(qū)蟲對照組中的優(yōu)勢差異菌屬，顯著高于經(jīng)兩種驅(qū)蟲方式驅(qū)蟲的給藥組。兩種驅(qū)蟲方式降低了梭菌科和梭狀屬的相對豐度可能對于其腸道菌群結構的改善有益。

本試驗采用伊維菌素的兩種劑型的驅(qū)蟲方式均顯示良好效果，且對出宿主腸道菌群整體組成結構幾無影響，而梭菌科、梭菌屬相對豐度的顯著下降可能對動物健康有益。兩種驅(qū)蟲方式未對綿羊正常生理功能造成不利影響，也間接支持其安全性較好。