王潔,黃欣愛，2,王利紅*

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 江蘇 泰州 225300;2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

SIRT4是沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirtuin，sirt)家族中的一員，其在動(dòng)物機(jī)體組織中的分布較為廣泛，具有NAD+依賴的蛋白脂酰胺酶、ADP-核糖體轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸激酶的活性。在細(xì)胞生存、衰老和代謝等生物過程中，SIRT4通過谷氨酸脫氫酶(GDH)ADP核糖基化，限制GDH活性，影響谷氨酸代謝和細(xì)胞能量代謝，減少氨基酸刺激的胰島素顆粒分泌。此外，SIRT4還具有抑制丙酮酸脫氫酶活性，繼而影響脂肪酸氧化的功能[1-4]。在疾病防治方面，SIRT4具有調(diào)控低氧誘導(dǎo)的心肌凋亡，降低慢性阻塞性肺病的發(fā)病率，抑制腫瘤形成和增殖等功能[3]。桂林生[5]對(duì)秦川肉牛SIRT4基因SNPs及其與生長(zhǎng)性狀和肉質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，在3′UTR區(qū)域檢測(cè)到g.16195C>A和g.16247A>G的 2個(gè)突變位點(diǎn)，g.16195C>A位點(diǎn)存在2種基因型，g.16247A>G 位點(diǎn)存在3種基因型，g.16247A>G以及 H4H3組合單倍型均與部分秦川肉牛生長(zhǎng)發(fā)育和肉質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)，表明SIRT4可以作為候選基因應(yīng)用于秦川肉牛改良育種工作中。Jin等[6]對(duì)通城豬SIRT家族基因序列進(jìn)行了檢測(cè)分析，在腦、心臟、腎臟、肺臟、胃、腸、腹脂、肌肉等組織中檢測(cè)到SIRT4 mRNA的表達(dá)。然而，截至目前，尚未見SIRT4蛋白在豬不同臟器組織中表達(dá)定位的研究。本研究以蘇姜豬為試驗(yàn)對(duì)象，通過免疫組織化學(xué)和ELISA檢測(cè)方法分析不同臟器組織中SIRT4蛋白的表達(dá)與定位，為深入研究SIRT4蛋白在豬各組織中的功能，進(jìn)而為蘇姜豬優(yōu)質(zhì)性狀的持續(xù)選育與提高提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

試驗(yàn)動(dòng)物：來自江蘇姜曲海種豬場(chǎng)。選取健康無病、系譜清楚、體重(25±0.65) kg左右的蘇姜豬公豬(去勢(shì))和母豬各3頭，飼喂4個(gè)月，試驗(yàn)豬的飼養(yǎng)管理方式和防疫措施均一致。

主要試劑：一抗SIRT4抗體(ab231137)、二抗羊抗兔(ab6721)均為英國(guó)ABCAM公司產(chǎn)品；SIRT4豬ELISA檢測(cè)試劑盒(Angle Gene, ANG-E31372P)購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)豬飼喂4個(gè)月后屠宰，屠宰后立即采集豬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器組織和心肌、背最長(zhǎng)肌、腿肌等肌肉組織。分別取上述各組織樣品，修整成約2 cm×2 cm的組織塊，置于甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另分別取每種組織樣品，并分成3份(用于重復(fù)試驗(yàn))，分裝在Eppendorf(EP)管中，置于液氮中，用于后續(xù)試驗(yàn)的ELISA檢測(cè)。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將各組織樣石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化處理后，用Tris-EDTA(pH=9)作為抗原修復(fù)液，微波高溫加熱進(jìn)行熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，用TBS洗滌3次后，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫中孵育30 min，用TBS緩沖液(pH 7.4)浸泡后洗滌3次，以5%胎牛血清(BSA)均勻覆蓋組織，37 ℃血清封閉40 min，棄掉封閉液，使用5%goat-3%BSA-PBST稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，取出切片室溫復(fù)溫1 h，用PBST浸泡5 min，清洗后加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色，以蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

將組織樣用pH 7.0～7.2，0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗凈后，取約1.0 g 組織塊移至10 mL EP管中，加入適量磷酸鹽緩沖溶液和蛋白酶抑制劑PMSF，勻漿3次，13 000 r/min離心5 min，取上清，按照SIRT4 ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，最后在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 19.0單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIRT4蛋白在蘇姜豬組織中的表達(dá)定位分布

通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)蘇姜豬肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器以及心肌、背最長(zhǎng)肌和腿肌組織中SRIT4蛋白表達(dá)分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。SIRT4蛋白免疫陽性顆粒主要分布于肺臟組織的肺泡上皮層和支氣管的黏膜層細(xì)胞(圖1A)，肝臟組織的肝細(xì)胞(圖1B)，脾臟組織的紅髓區(qū)細(xì)胞(圖1C)，腎臟組織的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞(圖1D)，胃(圖1H)、大腸(圖1I)和小腸(圖1J)組織的腺細(xì)胞，心肌(圖1E)、背最長(zhǎng)肌(圖1F)和腿肌(圖1G)組織的肌細(xì)胞質(zhì)中。

A. 肺臟(100×)；B. 肝臟(200×)；C. 脾臟(100×)；D. 腎臟(200×)；E. 心肌(200×)；F. 背最長(zhǎng)肌(200×)；G. 腿肌(200×)；H. 胃(100×)；I. 大腸(100×)；J. 小腸(100×)

2.2 蘇姜豬組織中SIRT4蛋白表達(dá)水平

通過ELISA方法檢測(cè)SIRT4蛋白在蘇姜豬肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸的臟器組織，以及心肌、背最長(zhǎng)肌、腿肌的肌肉組織中的表達(dá)水平，試驗(yàn)結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)分析公豬(去勢(shì))和母豬各組織中SIRT4蛋白的表達(dá)量，分析結(jié)果顯示，公豬(去勢(shì))胃和小腸組織中的表達(dá)量相對(duì)較高，顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是大腸組織中的表達(dá)量(P<0.05)；母豬組織中，大腸和小腸組織中的表達(dá)量相對(duì)最高，顯著高于其他組織(P<0.05)。用豬組織中SIRT4蛋白表達(dá)量從高到低依次為大腸、小腸、腎臟、肝臟、背最長(zhǎng)肌、腿肌、心肌、脾臟、胃、肺臟組織。

SIRT4蛋白除了在公豬(去勢(shì))腎臟和大腸組織中表達(dá)量稍低于母豬外，其他組織中公豬SIRT4蛋白的表達(dá)量均高于母豬，在肝臟、脾臟、肺臟、胃、小腸、心肌、背最長(zhǎng)肌、腿肌組織中SIRT4蛋白的表達(dá)量分別是母豬組織中表達(dá)量的1.02、1.24、1.48、1.80、1.04、1.48、1.09、1.27倍。統(tǒng)計(jì)分析公母蘇姜豬同一組織樣中SIRT4蛋白表達(dá)量，蘇姜公豬(去勢(shì))肺臟、腿肌、胃和脾臟組織中SIRT4蛋白的表達(dá)量顯著高于母豬相應(yīng)組織中表達(dá)量(P<0.05)。

表1 蘇姜豬組織樣中SIRT4蛋白表達(dá)量 pg/mL

3 討論

SIRT4蛋白作為sirtuins家族中的一員，在調(diào)控動(dòng)物機(jī)體脂肪酸的氧化和能量代謝過程中發(fā)揮者至關(guān)重要的作用[7]。SIRT4是一種NAD+依賴的ADP核糖基化酶，抑制SIRT4基因表達(dá)可以在線粒體和核仁中刺激逆行信號(hào)的發(fā)生，其中涉及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase， AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase)以及線粒體呼吸機(jī)能相關(guān)的因子，表明SIRT4基因在維持 ATP 的平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[8]。在豬的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃、腸、腹脂、肌肉等組織中已檢測(cè)到SIRT4 mRNA的表達(dá)[6]。本研究通過ELISA和免疫組織化學(xué)方法在蘇姜豬的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸等臟器組織，以及心肌、背最長(zhǎng)肌、腿肌等肌肉組織中，均檢測(cè)到SIRT4蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步表明SIRT4基因在豬組織中的表達(dá)具有廣泛性。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也驗(yàn)證了Jin等[6]有關(guān)SIRT4 mRNA基因在豬臟器組織中的表達(dá)的研究結(jié)果。

通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法，在蘇姜豬的心肌、背最長(zhǎng)肌、腿肌組織的肌細(xì)胞中檢測(cè)到明顯的SIRT4免疫陽性顆粒，經(jīng)ELISA測(cè)定，結(jié)果也顯示SIRT4蛋白在肌肉組織中表達(dá)量相對(duì)較高，表明SIRT4在肌肉組織收縮運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的作用。Liu等[9]研究表明，心臟中SIRT4還能夠影響前體半胱天冬酶向半胱天冬酶轉(zhuǎn)化的比率，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控低氧誘導(dǎo)心肌凋亡的作用[9]。本試驗(yàn)除肌肉組織外，在消化系統(tǒng)如胃、大腸、小腸的腺細(xì)胞中也檢測(cè)到明顯的SIRT4蛋白免疫陽性顆粒，表明SIRT4與腺細(xì)胞的功能密切相關(guān)。ELISA測(cè)定結(jié)果也顯示，消化系統(tǒng)中SIRT4蛋白表達(dá)量相對(duì)高于其他組織，表明SIRT4蛋白參與蘇姜豬消化系統(tǒng)的物質(zhì)消化代謝過程。

腎臟的主要功能包括維持機(jī)體內(nèi)水、電解質(zhì)和酸堿平衡；產(chǎn)生多種激素，參與調(diào)節(jié)血壓、造血等生理活動(dòng)；參與維生素D的活化；通過生成尿液，排泄體內(nèi)的代謝產(chǎn)物等。通過免疫組織化學(xué)方法，在蘇姜豬腎臟組織的近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞中檢測(cè)到豐富的SIRT4免疫陽性顆粒，但在腎小球中分布極少，表明SIRT4在原尿的重吸收和離子的交換過程中具有重要作用。肝臟組織中SIRT4與過氧化物酶體增殖物激活受體-α(hepatic peroxisome proliferator activated receptor,PPAR-α)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，敲除SIRT4基因小鼠的肝臟中PPAR-α表達(dá)量升高，脂肪酸分解速度受到抑制，而過表達(dá)SIRT4則結(jié)果相反[10]。肺組織中，SIRT4的表達(dá)與部分炎癥因子的活性存在關(guān)聯(lián)，如Chen等[11]在香煙煙霧提取物處理過的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) SIRT4 表達(dá)量明顯下降，在這些細(xì)胞中過表達(dá)SIRT4 后，能夠減弱血管細(xì)胞黏附分子1和選擇蛋白 E-selectin 的誘導(dǎo)，同時(shí)抑制 NF-κB、IL-1β和 TNF-α等炎癥因子的活性，說明SIRT4可能具有減緩慢性阻塞性肺病的發(fā)生率[11]。本試驗(yàn)經(jīng)免疫組織化學(xué)方法，在蘇姜豬肝細(xì)胞和肺組織肺泡上皮層和支氣管的黏膜層細(xì)胞中均檢測(cè)到豐富的SIRT4免疫陽性顆粒，表明SIRT4在蘇姜豬的肝功能和肺組織的氣體交換功能中具有重要的作用。

對(duì)比公(去勢(shì))母蘇姜豬各組織中SIRT4蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，除腎臟和大腸組織的表達(dá)量稍有不同外，公豬組織中SIRT4的表達(dá)量均相對(duì)高于母豬，特別是在胃、肺臟、脾臟和腿肌中的表達(dá)量顯著高于母豬。這表明，SIRT4在動(dòng)物組織中的表達(dá)水平可能與性別、不同組織的物質(zhì)和能量代謝強(qiáng)弱程度有關(guān)。

4 結(jié)論

通過ELISA和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，SIRT4在蘇姜豬組織中的表達(dá)具有廣泛性，且SIRT4主要定位于肌肉組織的肌細(xì)胞、肺組織肺泡上皮和支氣管黏膜層細(xì)胞、肝臟肝細(xì)胞、脾臟紅髓區(qū)細(xì)胞、腎臟近曲小管和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞、胃和腸組織腺細(xì)胞。不同組織之間SIRT4表達(dá)量存在一定差異，公豬(去勢(shì))多數(shù)組織中SIRT4表達(dá)量相對(duì)高于母豬，特別是在物質(zhì)和能量代謝旺盛的組織(如小腸、大腸、肝臟、腎臟)中有相對(duì)較高的表達(dá)量，表明SIRT4在蘇姜豬各臟器的物質(zhì)能量代謝過程中具有重要的作用。