丁美娟,周永銀,張懿,張丹,周勇岐*，尹秀鳳,張小飛

(1.兆豐華生物科技(南京)有限公司，江蘇 南京 211102;2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae, MS)引起雞滑液囊炎，該病一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)多發(fā)[1]。MS自然感染最早可發(fā)生在1周齡[2]，但急性感染通常見于4～16周齡，在急性感染期之后出現(xiàn)的慢性感染可持續(xù)終生，發(fā)病率一般為5%～15%，死亡率約為1%～10%[3]。MS除了可以通過隱性感染雞和病雞的水平傳播外，還可以垂直傳播，經(jīng)蛋傳播給子代，感染初期經(jīng)卵傳播率較高。在我國，無論是商品肉雞、蛋雞或種雞[4-5]，MS引起的傳染性滑膜炎和感染均有發(fā)生，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。近年來我國雞群MS感染的報道較多，對MS生物學(xué)特性、免疫原性及診斷方法的研究報道也較多[6-9]，但對MS感染的病理變化報道較少。本試驗以1例自然感染MS、表現(xiàn)為典型臨床癥狀的病例為研究對象，進行了病理組織學(xué)觀察。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來自江蘇某養(yǎng)殖場，10只50日齡左右的疑似MS感染病雞。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

MS陽性菌株GX11-T株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑

DNA提取試劑盒、DNA Taq酶、dNTP和分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DNA Marker購自大連寶生物技術(shù)有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇、甲醛等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 流行病學(xué)調(diào)查與臨床觀察

對發(fā)病雞場雞群年齡、發(fā)病率等發(fā)病情況進行調(diào)查，觀察發(fā)病雞的臨床癥狀和病死雞的剖檢變化，記錄結(jié)果并作出初步診斷。

1.5 病料的PCR檢測

采用PCR的檢測技術(shù)，參考丁美娟等[10]建立的對臨床疑似MS病變主要侵害部位雞腫脹跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)容物進行MS病原檢測。

根據(jù)雞滑液囊支原體16S rRNA基因(N-R044811)序列設(shè)計的引物，預(yù)期擴增目的片段大小為1 077 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物P1： 5′-CCTACGGGAGGCAGCAGT-3′;

下游引物P2： 5′-AGGCAGTCGTGTCCCAAGGTC-3′。

1.6 病理組織學(xué)觀察

將病雞關(guān)節(jié)、爪墊、肝臟、腎臟、胸腺等組織，用10%中性甲醛溶液固定組織，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后觀察其病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)及臨床檢查

2018年10月份，該養(yǎng)殖場存欄15 100只海蘭褐蛋雞，在50日齡左右，雞出現(xiàn)跛行、采食量下降、精神沉郁、羽毛粗亂，有的發(fā)病雞消瘦、關(guān)節(jié)腫大、爪墊腫脹，龍骨滑液囊處有囊腫，部分雞的排泄物可見大量尿酸或綠色的尿酸鹽沉積，疑似MS感染，發(fā)病率約2%。

2.2 PCR檢測

對送檢的疑似MS病雞腫脹跗關(guān)節(jié)腔內(nèi)容物直接進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下可見約1 077 bp特異性條帶，與目的片段大小一致，見圖1。

M.DL2000 DNA Marker; 1. MS陽性對照GX11-T; 2～7. 檢測樣品; 8. 陰性對照

2.3 PCR產(chǎn)物測序與分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過克隆、序列測定后，通過在線BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，檢測樣品與NCBI收錄MS的16S rRNA基因序列同源性較高，同源性約92%～98%，證明該檢測樣品為MS感染。

2.4 剖檢變化

解剖病雞關(guān)節(jié)滑膜組織有黏性滲出物(圖2A)，爪墊腫脹，分泌黏性滲出物(圖2B)，龍骨的滑液囊有黃白色纖維素性干酪樣物質(zhì)(圖2C)；病雞氣管、肝、脾、腎等無肉眼可見病變。

A. 跗關(guān)節(jié)黏性滲出物; B. 爪墊腫脹,分泌黏性滲出物; C. 龍骨黃白色纖維素性干酪樣物質(zhì)

2.5 病理組織學(xué)觀察

肝臟：肝臟主要變化為肝小葉中央靜脈和周圍的肝竇擴張，充有大量紅細胞，血管內(nèi)皮細胞腫脹，匯管區(qū)周圍少量炎癥細胞浸潤(圖3A)。

腎臟：腎組織大面積灶性出血，腎小球擴張，毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、增生，腎小管上皮細胞與基底膜分離形成一環(huán)狀空白區(qū)(圖3B)。

胰臟：胰島中可見淋巴細胞浸潤，腺泡排列較疏松，炎癥細胞灶性浸潤(圖3C)。

胸腺：胸腺髓質(zhì)中有明顯出血和充血，大量血管擴張淤血以及炎性細胞浸潤(圖3D)。

法氏囊：法氏囊皮質(zhì)與髓質(zhì)界限模糊，皮質(zhì)細胞大量減少消失，髓質(zhì)細胞較疏松(圖3E)。

小腸：腸黏膜層絨毛結(jié)構(gòu)不完整，部分僅見裸露的固有層結(jié)構(gòu)，腸腔內(nèi)可見大量脫落的細胞，腸腺較豐富，肌層纖維排列折皺狀(圖3F)。

爪墊：部分真皮結(jié)蹄組織疏松、壞死，大量異嗜性細胞浸潤和少量淋巴細胞浸潤(圖3G)。

關(guān)節(jié)：關(guān)節(jié)腔內(nèi)以異嗜性細胞為主的炎性細胞崩解壞死，并伴有少量紅細胞滲出(圖3H)；關(guān)節(jié)囊結(jié)締組織壞死，有巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤(圖3I)。

A.肝臟; B. 腎臟; C.胰臟; D.胸腺; E.法氏囊; F.小腸; G.爪墊; H. 跗關(guān)節(jié)腔; I. 關(guān)節(jié)囊

3 討論

對MS感染雞各組織器官病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，病雞大部分組織器官的實質(zhì)細胞均受到不同程度的病理性損傷。病理學(xué)觀察結(jié)果同時顯示，MS病原主要侵害部位關(guān)節(jié)和爪墊，腔囊內(nèi)均有大量膿液和炎性細胞滲出、崩解、壞死，與聶立欣等[11]報道一致。病雞爪墊部分真皮結(jié)蹄組織疏松，壞死，大量異嗜性細胞浸潤和少量淋巴細胞浸潤，部分形成膿液。這些病變導(dǎo)致發(fā)病雞出現(xiàn)跛行、癱瘓。另外MS感染雞肝臟等多處組織炎性細胞浸潤，肝臟血管內(nèi)皮細胞腫脹，腎組織大面積灶性出血，可見MS感染雞存在血液循環(huán)障礙。胸腺髓質(zhì)充血、出血以及炎性細胞浸潤，法氏囊皮質(zhì)細胞減少，導(dǎo)致機體免疫能力下降，該發(fā)現(xiàn)進一步證實了MS不僅導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎和滑膜炎的發(fā)生，同時導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩，甚至?xí)l(fā)免疫系統(tǒng)的抑制[12]。

MS感染已經(jīng)遍及全球，尤其近幾年來，我國MS感染常呈暴發(fā)趨勢，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。2013年第18屆世界禽病大會，就有專家提出“現(xiàn)在以及不遠的將來MS的危害會超過雞毒支原體(MG)”的觀點[13]。國內(nèi)外雖然已有許多關(guān)于MS的報道，但國內(nèi)大部分報道基于病雞的臨床癥狀和剖檢病理變化所作出的診斷，有關(guān)MS病理組織學(xué)研究尚不多見。本試驗后期對該例臨床樣品進行了進一步實驗室病原檢測，排除了沙門氏菌、金黃色葡萄菌等細菌病，病毒性關(guān)節(jié)炎等病毒病混合感染；參考丁美娟等[14-15]MS分離和鑒定技術(shù)，進一步進行了SPF雞人工感染試驗，復(fù)制出典型的MS自然病例，說明該雞場送檢的疑似MS病雞為單一、純凈MS病原感染。本研究通過MS臨床典型發(fā)病病例進行系統(tǒng)的病理學(xué)觀察，為該病的診斷提供可靠的依據(jù)，豐富了MS感染雞的病理學(xué)資料。