唐冰雯,林秀蓮,李華

(1.廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510450；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510663)

菟絲子收載于《中國(guó)藥典》2015年版，為旋花科植物南方菟絲子(CwscwiaaustralisR.Br.)或菟絲子(CuscutachinensisLam.)干燥成熟種子，辛、甘，平，歸肝、腎、脾經(jīng)?？裳a(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉，外用消風(fēng)祛斑[1]。研究發(fā)現(xiàn)菟絲子主要藥效成分除常見(jiàn)的黃酮類化合物外，還有酚酸類和木質(zhì)素類等化合物[2-4]，具有多種功效如保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、促性腺激素樣等[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)菟絲子中的黃酮類化合物進(jìn)行質(zhì)量控制[6-8]，而由于市售的菟絲子藥材品種繁多，產(chǎn)地廣泛，且存在生產(chǎn)和來(lái)源的差異，進(jìn)而出現(xiàn)藥材的質(zhì)量差異從而影響其藥效及臨床的合理應(yīng)用。在建立了菟絲子飲片指紋圖譜及含菟絲子成分的補(bǔ)腎強(qiáng)身片的質(zhì)量控制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究等前期研究基礎(chǔ)上[9-10]，為了進(jìn)一步全面、快速、準(zhǔn)確地控制菟絲子的質(zhì)量，本試驗(yàn)選擇黃酮類中的金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚及具備抗炎作用的酚酸類物質(zhì)綠原酸，作為菟絲子的質(zhì)量控制指標(biāo)，并以此建立超高效液相色譜(UPLC)法同時(shí)測(cè)定這5類化學(xué)成分的含量，為進(jìn)一步提高和完善菟絲子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

島津Nexera LC-30A超高效液相色譜儀，配有LC30-AD二元泵，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M30A PDA檢測(cè)器，CTO-20AC柱溫箱；KQ-300DE型超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(Sartorius CP224S及CP225D)。乙腈，色譜純(美國(guó)Honeywell公司)；甲醇和甲酸，分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

紫云英苷對(duì)照品(含量：98.0%，批號(hào)：480104)，購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；異槲皮苷對(duì)照品(含量：92.9%，批號(hào)：111809-201403)，山柰素對(duì)照品(含量：95.5%，批號(hào)：110861-201310)、金絲桃苷對(duì)照品(含量：94.3%，批號(hào)：111521-201507)、綠原酸對(duì)照品(含量：96.2%，批號(hào)：110753-201415)均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。樣品為來(lái)源于19個(gè)生產(chǎn)廠家的菟絲子藥材共20批次，經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所中藥室林錦峰主任鑒定均為旋花科植物南方菟絲子(CwscwiaaustralisR.Br.)或菟絲子(CuscutachinensisLam.)干燥成熟種子。藥材樣品覆蓋全國(guó)9省(市)包括北京、安徽、河北、甘肅、浙江、青海、江蘇、廣西、四川等，詳見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)作為流動(dòng)相，梯度洗脫(程序?yàn)?～4 min，7%→9%A；8～11 min，13%A；11～18 min，13%→14%A；18～24 min，14%→30%A；24～30 min，30%→31%A)；柱溫：35 ℃；分段檢測(cè)波長(zhǎng)(1～5 min，325 nm； 5～12 min，260 nm；12～30 min，360 nm)；體積流量：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取菟絲子粉末適量過(guò)二號(hào)篩，精密稱定約1 g，置50 mL量瓶中，加入40 mL的80%甲醇，采用超聲處理60 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放冷后用80%甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即可。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成混合對(duì)照貯備液(每1 mL含異槲皮苷180.60 μg、紫云英苷173.07 μg、金絲桃苷226.32 μg、山柰酚173.28 μg、綠原酸200.09 μg)。

2.3 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制成的混合對(duì)照溶液(含異槲皮苷22.57 mg·L-1、紫云英苷21.63 mg·L-1、金絲桃苷28.29 mg·L-1、山柰酚21.65 mg·L-1、綠原酸25.01 mg·L-1)和供試品溶液各2 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。異槲皮苷、紫云英苷、金絲桃苷、山柰酚、綠原酸與相鄰的色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論板數(shù)以各成分色譜峰計(jì)算均在6 000以上。

A.混合對(duì)照溶液；B.樣品 1-綠原酸(chlorogenic acid)；2-金絲桃苷(hyperoside)；3-異槲皮苷(isoquercitrin)；4-紫云英苷(astragalin)； 5-山柰素(kaempferol)圖1 混合對(duì)照品系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖

2.4 線性與范圍 精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照溶液適量，逐級(jí)稀釋到不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照溶液異槲皮苷(180.60、90.30、45.15、22.57、11.29、2.26、0.45 mg·L-1)；紫云英苷(173.07、86.53、43.27、21.62、10.87、2.16、0.43 mg·L-1)；金絲桃苷(226.32、113.16、56.58、28.29、14.14、2.83、0.56 mg·L-1)；山柰酚(173.28、86.62、43.31、21.65、10.83、2.16、0.43 mg·L-1)；綠原酸(200.09、100.05、50.02、25.01、12.51、2.50、0.50 mg·L-1)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C(mg·L-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，5種成分峰面積與濃度的線性關(guān)系良好(r>0.999 9)

2.5 檢測(cè)限與定量限 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，通過(guò)稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品得到5種成分的定量限(S/N為10)和檢測(cè)限(S/N為3)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種成分的回歸方程和線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照溶液(含異槲皮苷22.57 mg·L-1、紫云英苷21.63 mg·L-1、金絲桃苷28.29 mg·L-1、山柰酚21.65 mg·L-1、綠原酸25.01 mg·L-1)，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=5)，考察方法的精密度。測(cè)定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均峰面積分別為426 025、345 229、266 540、215 548、465 495，峰面積RSD分別為0.38%、0.79%、0.99%、1.46%、0.65%，說(shuō)明該儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)160201的同一份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，選用峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)，考察方法的穩(wěn)定性。測(cè)定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均峰面積分別為655 981、724 005、100 986、169 143、201 480、峰面積RSD分別為0.30%、0.36%、0.63%、0.22%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：160201)，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)，考察方法的重復(fù)性。分別測(cè)定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均含量為1.9370、3.0113、0.4268、0.9163、0.4712 mg·g-1，峰面積RSD為1.85%、1.59%、1.18%、2.36%、2.64%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷及山柰酚含量的菟絲子樣品(批號(hào)：160201)約0.5 g，共9份，于每3份中分別加入近似1∶0.5、1∶1、1∶1.5的各個(gè)對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。5種化合物的平均回收率(n=9)分別為102.0%(RSD=1.56%)、99.0%(RSD=2.90%)、100.1%(RSD=3.19%)、100.2%(RSD=3.00%)、99.3%(RSD=4.25%)，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.10 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取20批次供試品溶液2 μL，進(jìn)樣測(cè)定。選用外標(biāo)法分別計(jì)算綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和山柰酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。比較20批次樣品5種成分含量及總含量發(fā)現(xiàn)，大部分廠家生產(chǎn)的菟絲子質(zhì)量一致性較好，也有部分批次樣品5種成分含量及總含量較低，存在一定差異。

表4 5種成分含量測(cè)定結(jié)果(n≥3)

3 討論

本文測(cè)定的菟絲子化學(xué)成分可分為黃酮類和酚酸兩大類，其中金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和山柰酚為黃酮類，綠原酸為酚酸類。通過(guò)考察不同比例的甲醇-水(40∶60、80∶60、100∶0)來(lái)尋找最佳提取溶劑，結(jié)果顯示甲醇-水(80∶20)提取率最高，故采用甲醇-水(80∶20)作為提取溶劑。試驗(yàn)還考察了加熱回流法和超聲提取法兩種不同提取方式，結(jié)果顯示兩種提取方法的提取結(jié)果相近，考慮到試驗(yàn)的簡(jiǎn)便性，選用超聲提取的方法。同時(shí)還分別考察20、40、60、80 min的超聲提取效果，結(jié)果表明60 min與80 min的超聲提取率接近，為了縮短試驗(yàn)時(shí)間，采用超聲提取60 min為宜。對(duì)于InertSustainSwiftTMC18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)、Agilent SB-C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、WatersACQUITYTMBEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)等3種不同廠家和不同粒徑的色譜柱也進(jìn)行了考察，結(jié)果表明以上3種色譜柱均可實(shí)現(xiàn)較好的分離樣品，獲得良好的峰形和分離度。此外，選用二極管陣列檢測(cè)器來(lái)記錄200～400 nm的紫外吸收光譜圖，結(jié)果表明，綠原酸在325 nm處有較好的吸收，金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和山柰酚均在360 nm處有較好的吸收，且為了基線更加平穩(wěn)，選擇分段波長(zhǎng)檢測(cè)：0～5 min，325 nm；5～12 min，260 nm；12～30 min，360 nm。

從各廠家批次樣品含量分析結(jié)果來(lái)看，發(fā)現(xiàn)綠原酸含量在0.832 7～2.142 6 mg·g-1之間，金絲桃苷含量在2.282 5～4.287 6 mg·g-1之間，異槲皮苷含量在0.856～0.488 6 mg·g-1之間，紫云英苷含量在0.896 1～1.548 8 mg·g-1之間，山柰酚含量在0.032 6～0.786 3 mg·g-1。不同的廠家和生產(chǎn)批號(hào)的菟絲子飲片中5種化學(xué)成分的含量接近，但是仍出現(xiàn)了個(gè)別樣品的酚酸及黃酮類物質(zhì)含量偏低的情況。可能原因考慮為不同廠家的地域氣候等因素及不同批號(hào)間飲片不同的生產(chǎn)時(shí)間和貯存條件的所帶來(lái)的差異。

本試驗(yàn)系統(tǒng)考察了樣品前處理方法和色譜條件對(duì)菟絲子中酚酸類和黃酮類成分含量測(cè)定方法的影響，并在此基礎(chǔ)建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的UPLC法同時(shí)測(cè)定菟絲子中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、和山柰酚5種成分的含量，并對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。UPLC法靈敏度高、穩(wěn)定性好，本試驗(yàn)所建立的含量測(cè)定方法適用于菟絲子藥材的質(zhì)量控制研究，為進(jìn)一步提高和完善菟絲子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。