修 磊，常 娜，姜 濤*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100038； 2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京 100069)

磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate，S1P) 是一種具有生物活性的分子，其對(duì)很多生理功能及病理過(guò)程都發(fā)揮著調(diào)控作用。鞘胺醇激酶(sphingosine kinase, SphK)是控制 S1P 合成的限速酶。大量的研究證據(jù)表明 S1P 參與多種疾病各種器官的纖維化發(fā)生，如腎纖維化，肝纖維化，心肌纖維化，肺纖維化及胰腺纖維化[1-4]。胰腺纖維化發(fā)生的特點(diǎn)為胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化成為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFs)，從而形成大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在胰腺內(nèi)沉積，表現(xiàn)為平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-smooth muscle actin, α-SMA)以及細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分I 型膠原 [collagen α1(I), Col α1(I)] 和 III 型膠原 [collagen α1(III), Col α1(III)]產(chǎn)生增加[5]。肌成纖維細(xì)胞來(lái)源廣泛，多種因素導(dǎo)致胰腺損傷，胰腺星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白 α，并在胰腺內(nèi)產(chǎn)生膠原促進(jìn)胰腺纖維化的發(fā)生[6]。在纖維化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)也發(fā)揮了很重要的作用，TGF-β1 是膠原產(chǎn)生過(guò)程中一種重要的介質(zhì)，同時(shí)能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化[7-8]。

本研究試圖探討 SphK/S1P及TGF-β1在KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化并產(chǎn)生膠原過(guò)程中的作用。這方面的研究將有助于我們更深入地了解糖尿病相關(guān)胰腺纖維化的發(fā)生機(jī)制，可能對(duì)糖尿病相關(guān)胰腺纖維化的預(yù)防及治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中使用了SPF級(jí)雄性KkAy2型糖尿病小鼠和C57BL/6J對(duì)照小鼠各7只，日齡49～56 d，均體重18～22 g，均來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[SCXK(京)2015-0004]。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(京)2015-0022]，單籠飼養(yǎng)。KkAy2型糖尿病小鼠給予高脂飲食(購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)；C57BL/6J小鼠給予普通飼料。所有小鼠均自由進(jìn)食、進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)福利倫理審查(AEEI-2017-090)。上述動(dòng)物的取材于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)中采集小鼠胰腺組織用于實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑購(gòu)買(mǎi)自加利福尼亞應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；其他常用試劑購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Real-time PCR

從新鮮的胰腺標(biāo)本中提取總RNA使用的試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen 公司。我們的實(shí)驗(yàn)使用美國(guó)ABI Prism 7300序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)。PCR相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence list

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化增加

既往的研究表明，胰腺星狀細(xì)胞的活化在胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用[9]。本研究應(yīng)用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)KkAy2型糖尿病小鼠和C57對(duì)照小鼠胰腺中反映胰腺星狀細(xì)胞活化的指標(biāo)α-SMA的水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺高表達(dá) α-SMA達(dá)5.3倍(表2、圖 1)，這一結(jié)果表明與正常對(duì)照組小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化增加。

注：C57對(duì)照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)(圖2A)和Col α1(III)(圖2B)的mRNA表達(dá)水平比較。所有結(jié)果均在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。與對(duì)照組相比，*P <0.05。圖2 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中膠原表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組Note. mRNA expression of Col α1(I) (2A) and Col α1(III) (2B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 2 Collagen mRNA expression was up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

2.2 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺膠原表達(dá)增加

胰腺星狀細(xì)胞活化后可產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)在胰腺內(nèi)沉積從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)產(chǎn)生增加。本研究應(yīng)用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)KkAy2型糖尿病小鼠和C57對(duì)照小鼠胰腺中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)的水平。結(jié)果表明與C57對(duì)照組相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)和Col α1(III)的水平都明顯增加，分別為對(duì)照組的7倍(圖2A)和3倍(圖2B)，這提示糖尿病會(huì)增加小鼠胰腺纖維化的發(fā)生。

表2 C57對(duì)照小鼠與KKAy 2型糖尿病小鼠 胰腺α-SMA表達(dá)Table 2 α-SMA mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

2.3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量增加

有研究表明 S1P 參與了多種組織纖維化時(shí)肌成纖維細(xì)胞活化過(guò)程[10]。既往的研究表明，TGF-β1是胰腺星狀細(xì)胞活化成為肌成纖維細(xì)胞的主要

注：C57對(duì)照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA的mRNA表達(dá)水平對(duì)比。所有結(jié)果均在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。與對(duì)照組相比，*P <0.05。圖1 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺高表達(dá)α-SMANote. mRNA expression of α-SMA in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.*P< 0.05.Figure 1 α-SMA mRNA expression was up-regulated in pancreas of KkAy type 2 diabetic mice

刺激因素之一[11]。研究證實(shí)，TGF-β1能促進(jìn)多種細(xì)胞，包括肝星狀細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及胰腺星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[7]。本研究應(yīng)用Real-time RT-PCR的方法檢測(cè)KkAy2型糖尿病小鼠和C57對(duì)照小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1的mRNA水平。結(jié)果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量分別為C57對(duì)照小鼠的2.6倍(圖3A)及15倍(圖 3B)，這提示，SphK1及TGF-β1可能參與了糖尿病相關(guān)胰腺纖維化的發(fā)生。

2.4 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1水平呈明顯正相關(guān)

我們之前的研究表明TGF-β1通過(guò)上調(diào)人肝肌成纖維細(xì)胞內(nèi)SphK1的表達(dá)和活化，從而誘導(dǎo)膠原表達(dá)[12]。為了探討KkAy2型糖尿病小鼠胰腺纖維化是否與TGF-β1誘導(dǎo)SphK1活化相關(guān)，我們對(duì)KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1等指標(biāo)的mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1、α-SMA、Col α1(I)及Col α1(III)水平均呈明顯正相關(guān)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 5)，這提示，TGF-β1與SphK1參與糖尿病相關(guān)胰腺纖維化的發(fā)生存在相關(guān)性。

3 討論

胰腺纖維化常常是與慢性胰腺炎和胰腺癌相伴隨的一種病理變化，可導(dǎo)致胰腺功能喪失。胰腺纖維化是胰腺癌的發(fā)病基礎(chǔ)，胰腺癌由于其不易早期發(fā)現(xiàn)及無(wú)有效治療方法成為惡性程度最高的腫瘤之一[13]。目前有大量的研究在尋找潛在有應(yīng)用價(jià)值的胰腺纖維化標(biāo)志物，但其敏感性和特異性并

注：C57對(duì)照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1(圖3A)及TGF-β1(圖3B)的mRNA表達(dá)水平比較。所有結(jié)果均在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。與對(duì)照組相比，*P<0.05。圖3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1表達(dá)水平明顯高于C57小鼠對(duì)照組Note. mRNA expression of SphK1 (3A) and TGF-β1 (3B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 3 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression were up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

表3 C57對(duì)照小鼠與KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺膠原表達(dá)Table 3 Collagen mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表4 C57對(duì)照小鼠與KkAy 2型糖尿病 小鼠胰腺SphK1及TGF-β1表達(dá)Table 4 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表5 SphK1與TGF-β1等指標(biāo)mRNA水平相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between mRNA levels of SphK1 and TGF-β1

不理想，因此研究胰腺纖維化發(fā)生的機(jī)制并尋找靶點(diǎn)能夠早期阻止或逆轉(zhuǎn)胰腺纖維化甚至是胰腺癌的發(fā)生有著重要的價(jià)值和意義[13-15]。目前關(guān)于胰腺纖維化有大量的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明胰腺星狀細(xì)胞的活化在胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，活化的胰腺星狀細(xì)胞可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及Hedgehog信號(hào)通路介導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展[5]。胰腺星狀細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞后表現(xiàn)為平滑肌肌動(dòng)蛋白α以及I 型膠原和 III 型膠原水平增加[16-17]。我們的研究表明與正常對(duì)照組C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA、Colα1(I) 及Colα1(III) 水平明顯增加，這表明糖尿病小鼠胰腺星狀細(xì)胞活化成為肌成纖維細(xì)胞，并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)胰腺纖維化的發(fā)生。與正常小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺纖維化發(fā)生明顯增加。為了探討KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中胰腺星狀細(xì)胞活化的機(jī)制，我們檢測(cè)了胰腺中SphK1與TGF-β1的水平，結(jié)果表明糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1的水平均明顯增加，并且二者呈明顯正相關(guān)。上述結(jié)果提示SphK1與TGF-β1參與了胰腺星狀細(xì)胞的活化及胰腺纖維化的發(fā)生。為了進(jìn)一步明確S1P在糖尿病小鼠胰腺纖維化發(fā)生過(guò)程中的作用，我們接下來(lái)的研究會(huì)在體外培養(yǎng)小鼠胰腺星狀細(xì)胞，通過(guò)給予SphK 的藥理學(xué)抑制劑 DMS或者用 RNA 干擾的方法特異性沉默胰腺星狀細(xì)胞中 SphK1 的表達(dá)，從而檢測(cè)高糖誘導(dǎo)下胰腺星狀細(xì)胞的活化及膠原水平的變化。此外，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KKAy2型糖尿病小鼠胰腺組織中TGF-β水平明顯高于對(duì)照組，并且SphK1與TGF-β水平呈明顯正相關(guān)，那么在糖尿病小鼠中是否因TGF-β水平升高進(jìn)而誘導(dǎo)SphK1激活胰腺星狀細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)胰腺纖維化的發(fā)生呢，這將在我們之后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

S1P 可以在細(xì)胞內(nèi)作為第二信使直接發(fā)揮作用，也可通過(guò) ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的S1P受體(S1P receptors，S1PRs)結(jié)合后激活不同的下游信號(hào)通路并誘導(dǎo)不同的生理及病理過(guò)程。有研究表明S1P參與了多種器官纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但其參與胰腺纖維化發(fā)生的機(jī)制目前仍不明確。胰腺纖維化發(fā)病的高危因素包括家族史、吸煙、肥胖、慢性胰腺炎以及糖尿病等[18-20]。目前有研究認(rèn)為胰腺纖維化甚至是胰腺癌的高發(fā)與糖尿病發(fā)病率的增加呈相關(guān)性[21-23]。大約85%的胰腺纖維化患者患有糖耐量異?；蛱悄虿24]。有學(xué)者認(rèn)為糖尿病導(dǎo)致胰腺纖維化發(fā)生率增高與高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗相關(guān)[20, 24-25]，然而其機(jī)制目前仍不明確，需要進(jìn)一步的研究。我們的研究已經(jīng)證實(shí)，糖尿病小鼠胰腺中高表達(dá)SphK1，這提示S1P可能參與了糖尿病相關(guān)胰腺纖維化的發(fā)生，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)我們還將探討S1P是通過(guò)與S1PRs結(jié)合參與胰腺纖維化的發(fā)生還是作為第二信使直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的。我們的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，在糖尿病小鼠胰腺中SphK1、TGF-β1、胰腺星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物α-SMA以及反映細(xì)胞外基質(zhì)水平的Colα1(I)及Colα1(III)水平都明顯增加，S1P參與這一過(guò)程是否通過(guò)其受體發(fā)揮作用呢？是否為T(mén)GF-β1誘導(dǎo)SphK1激活從而促進(jìn)胰腺星狀細(xì)胞活化促進(jìn)膠原產(chǎn)生呢？此外，在胰腺星狀細(xì)胞活化過(guò)程中，是否還有其他調(diào)控因子參與了高糖誘導(dǎo)SphK1表達(dá)的過(guò)程？這些問(wèn)題尚需進(jìn)一步深入研究。

目前，仍然缺乏有效的治療纖維化的方法。纖維組織一旦形成，很難修復(fù)成正常組織。因此，越來(lái)越多的研究致力于如何預(yù)防或減慢纖維化疾病發(fā)展及阻斷纖維化之前上游生物學(xué)過(guò)程。大量的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，S1P及其信號(hào)通路參與了多種組織纖維化的發(fā)展。此外，S1P和相關(guān)的信號(hào)通路構(gòu)成了復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并具有許多信號(hào)通路，例如炎癥，凋亡和自噬，并調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)展[4]。但是，目前的研究尚未完全闡明S1P作用的機(jī)制和相關(guān)的纖維化信號(hào)傳導(dǎo)途徑，它們?cè)诓煌鞴俸臀锓N中的作用不同，需要進(jìn)一步研究。此外，S1P的干預(yù)和相關(guān)的信號(hào)通路是與纖維化有關(guān)的疾病的潛在治療方法，S1P也有望在將來(lái)成為纖維化疾病嚴(yán)重程度的有效生物標(biāo)志物。