于忠娟，柴 峰，時寶林，張躍其，吳春麗

(1.山東省濰坊市第六人民醫(yī)院內(nèi)科，山東 濰坊 261000； 2.山東省濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濰坊 261000； 3.山東省濰坊市人民醫(yī)院產(chǎn)一科， 山東 濰坊 261000)

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由腦神經(jīng)元異常放電引起的大腦短暫功能障礙。全球約有7000萬癲患者，我國的癲癇發(fā)病率約30/10萬/年左右，患病率為4‰～7‰[1]，并有30%的癲癇患者無法通過抗癲癇藥物(anti-epileptic drug，AED)得到有效控制，進一步發(fā)展成為難治性癲癇或者頑固性癲癇[2]，給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)，迫切需要尋找到新的癲癇療法和藥物。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-GP)是一種跨膜蛋白，與藥物的細胞內(nèi)積累相關(guān)，研究表明其在癲癇患者大腦中過度表達并增加藥物排出，介導(dǎo)機體對AED的耐藥性[3]。

最近研究發(fā)現(xiàn)纈草根提取物(主要為纈草酸)不僅有效治療焦慮、失眠，還具有抗驚厥作用，增強了抗癲癇藥物的作用效果[4]，服用纈草根的癲癇患者會出現(xiàn)更好的治療效果，提示纈草酸具有潛在的神經(jīng)元保護作用[5]。目前少有關(guān)于纈草酸的基礎(chǔ)研究，尚不明確纈草酸針對癲癇影響的作用機制。本研究擬明確纈草酸聯(lián)合丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)對戊四唑(Pentylenetetrazole，PTZ)誘導(dǎo)癲癇小鼠的神經(jīng)元保護作用及對P-GP表達影響，從而為難治性癲癇的治療提供一種新有效手段。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SFP級6～8周健康雄性KM小鼠，共60只，購自山東大學(xué)實驗動物中心[SCXK(魯) 2019-0001]，體重(19.5±2.4)g，小鼠飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院動物房中[SYXK(魯)2019-0016]，飼養(yǎng)溫度為18℃～20℃。環(huán)境安靜、清潔，模擬自然晝夜。本實驗經(jīng)濰坊市第六人民醫(yī)院實驗動物倫理審查委員會審查(R0821050)。實驗過程按照《實驗動物管理與使用指南》進行，嚴格遵守動物使用3R原則，整個實驗過程均給予實驗小鼠以人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

纈草酸(加拿大Chromadex公司)；戊四唑(美國Sigma公司)；丙戊酸鈉(美國Sigma公司)；P-GP 及Cleaved-caspase-3小鼠一抗(美國Princeton，公司)；β-actin一抗(美國Abcam公司)；Western超敏發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)；DAPI封固劑(江蘇碧云天公司)；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)，臺式冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)，轉(zhuǎn)膜電泳儀(北京六一儀器廠)；石蠟切片機(德國Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

隨機分為6組: 正常對照組、模型對照組、VPA組、纈草酸+VPA組(低中高劑量各一組)，每組10只。

1.3.2 給藥

除正常對照組外，每組均于第1天、第3天、第5天、第8天、第10天及第12天進行1次PTZ腹腔注射(30 mg/kg)制備癲癇模型[6]，第12天腹腔注射后1 h連續(xù)觀察各組癲癇發(fā)作的等級、持續(xù)時間及潛伏時間。正常對照組按照PTZ給藥時段給予生理鹽水1 mL腹腔注射；VPA組及纈草酸+VPA組均灌胃給予VPA(30 mg/kg)，連續(xù)給藥12 d。在給藥VPA灌胃的同時，低、中、高劑量纈草酸+VPA組分別給予60、120和180 mg/kg纈草酸灌胃。

1.3.3 癲癇發(fā)作等級評分

以Racine評分評判小鼠癲癇發(fā)作等級[7]，標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：正常奔跑，無非應(yīng)激性反應(yīng)；1級：面部肌肉抽搐、顫動；2級：1級發(fā)作伴節(jié)律性點頭或前肢肌陣攣；3級：2級發(fā)作伴有前肢抽搐，無后肢痙攣、直立；4級：3級發(fā)作伴有后肢陣攣，或有摔倒、后肢直立；5級：全身性強直、后肢強直性延伸、癲癇持續(xù)狀態(tài)或死亡。

1.3.4 組織標(biāo)本采集

在進行末次行為學(xué)評估30 min后將各組取腦組織標(biāo)本，進行蛋白定量或甲醛組織固定。斷頭處死后，刨開顱腦，小心取出小鼠大腦，將其迅速放在冰上，眼科鑷剝離一側(cè)大腦半球皮層組織，放入液氮中保存，以備蛋白定量實驗。同時將另一側(cè)未分離大腦組織置于4%多聚甲醛固定，以備Tunel染色。

1.3.5 Western blot

為明確纈草酸是否能影響癲癇小鼠中P-GP及caspase-3活性片段，取新鮮皮層組織后進行Western blot檢測。腦組織中加入裂解液(1 mL/mg)，勻漿后在4℃下離心10 min。在樣品中加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min。每孔上樣量100 μg。十二烷基磺基聚丙烯酰胺鈉凝膠電泳(30 mA)分離蛋白質(zhì)，Marker接近膠底板時停止電泳。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，持續(xù)40 min，5%脫脂牛奶封閉，室溫勻搖2 h，將膜于P-GP一抗(1∶500)或Cleaved-caspase-3(1∶1000)4℃孵育過夜，37℃水浴中于HRP標(biāo)記二抗(1∶2000)孵育1 h，漂洗后加如ECL發(fā)光試劑。使用化學(xué)發(fā)光分析儀拍照，用Image-J軟件進行半定量分析。

1.3.6 Tunel染色

將各組小鼠腦組織進行Tunel染色，以觀察神經(jīng)元凋亡率。將冷凍切片浸入盛有4%多聚甲醛固定液的染色缸，固定20 min，浸入1×PBS 漂洗三次(每次5 min)；樣本片浸入通透液中，室溫促滲5 min，漂洗3次，每個樣本上滴加50 μL TdT 酶反應(yīng)液，放入溫盒中避光反應(yīng)60 min，漂洗3次，每個樣本上滴加50 μL Streptavidin-TRITC 標(biāo)記液，37℃避光反應(yīng)30 min。漂洗后DAPI 固封劑封片，室溫避光反應(yīng)10 min，上共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)表現(xiàn)

各組發(fā)作潛伏期及持續(xù)時間見表1。相較模型對照組，VPA組及不同劑量纈草酸+VPA組發(fā)作持續(xù)時間縮短，潛伏時間延長(P值均<0.001)。與VPA組比較，不同劑量纈草酸+VPA組發(fā)作持續(xù)時間縮短(P值均<0.001)，中劑量纈草酸+VPA組發(fā)作潛伏期延長(P=0.029)。進一步分析各組小鼠發(fā)作等級(圖1)，VPA組癲癇發(fā)作級別較模型對照組明顯下降(P<0.001)，而中劑量及高劑量纈草酸+VPA組癲癇發(fā)作級別較VPA組下降(P分別為<0.001、0.019)。以上結(jié)果表明，中劑量及高劑量纈草酸可降低癲癇模型小鼠的發(fā)展等級，且中劑量組改善更明顯。

2.2 大腦皮質(zhì)P-GP及Cleaved-caspase-3蛋白表達

癲癇發(fā)作72 h后，模型對照組大腦皮質(zhì)P-GP明顯高于正常對照組(P<0.001)，VPA組P-GP蛋白表達較模型對照組無明顯改變(P>0.05)，纈草酸低、中、高劑量組P-GP蛋白較VPA組下降(P分別為0.02、<0.001、<0.001)，見圖2、3。Cleaved-caspase-3(17kD)是caspase-3剪切后的活化形式，我們檢測了各組小鼠大腦皮質(zhì)cleaved-caspase-3表達。模型對照組Cleaved-caspase-3明顯高于正常對照組(P<0. 001)，VPA組表達較模型對照組明顯改變(P=0.004)，纈草酸中劑量組表達較VPA組下降(P=0.014)，見圖2、4。以上結(jié)果表明，相較于VPA治療，VPA聯(lián)合不同劑量纈草酸能有效降低癲癇模型小鼠大腦皮質(zhì)中P-GP蛋白表達，而VPA聯(lián)合中劑量纈草酸能減少Cleaved-caspase-3表達。

2.3 大腦皮質(zhì)細胞凋亡情況

本研究隨后檢測了各組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況。模型對照組神經(jīng)元凋亡較正常對照組明顯升高(P<0. 001)，VPA組凋亡率較模型對照組明顯降低(P<0.001)，纈草酸低、中、高劑量組凋亡率較VPA組下降(P分別為0.028、<0.001、<0.001)，見圖5、6。以上結(jié)果表明，相較于VPA治療，VPA聯(lián)合中劑量纈草酸能顯著降低癲癇模型小鼠神經(jīng)元凋亡率。

3 討論

目前AED有10余種，有1/3的患者無法通過AED得到有效的治療，進一步發(fā)展成為難治性癲癇或者頑固性癲癇[8]，AED的耐藥機制是癲癇治療過程中的關(guān)鍵，耐藥過程涉及多種不同的細胞機制[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，AED治療可促進多藥耐藥相關(guān)蛋白1基因(MRP1)及其蛋白產(chǎn)物P-GP的過度表達[11]，P-GP可以將抗癲癇藥泵回外周循環(huán)，這種再循環(huán)可能會降低大腦藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥性難治性癲癇和抗癲癇藥治療效果降低[12]。此外許多抗癲癇藥是P-GP的底物，癲癇發(fā)作本身可能會增加P-GP的表達[13]。已經(jīng)有研究證實部分藥物(如氟桂嗪、環(huán)氧合酶2等)能有效下調(diào)P-GP的表達，在難治性癲癇中具有潛在作用[14-15]。

表1 各組小鼠癲癇發(fā)作情況Table 1 Seizures of mice in each group

注：與模型對照組比較，***P<0.001；與VPA組比較，##P<0.001；與VPA組比較，#P<0.05。圖1 各組癲癇發(fā)作等級Note. Compared with model control group,***P<0.001. Compared with VPA group, ##P<0.001. Compared with VPA group,#P<0.05.Figure 1 Seizurelevel of each group

注：A：正常對照組；B：模型對照組；C：VPA組；D：低劑量纈草酸+ VPA組；E：中劑量纈草酸+ VPA組；F：高劑量纈草酸+ VPA組。圖2 Western blot檢測各組小鼠P-GP及 Cleaved-caspase-3蛋白表達Note. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid +VAP group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid +VPA group.Figure 2 Representative western blot of P-GP and Cleaved-caspase-3 protein in each group

本研究中，纈草酸聯(lián)合VPA可降低癲癇小鼠發(fā)作等級，相較單用VPA效果好，提示纈草酸可增強VPA的抗驚厥作用。纈草酸為纈草提取物中的主要成分，含有不同比例的羥基纈氨酸和乙酰氧基纈氨酸。纈草提取物已用于治療多種癥狀，如焦慮癥和失眠癥，已有超過2000年的歷史[17]。目前研究表明，纈草酸具有很強的抗驚厥作用，Torres-Hernndz等[16]發(fā)現(xiàn)纈草酸與氯硝西泮及苯妥英鈉具有協(xié)同相互作用，增強了兩者的抗驚厥作用，可延長成年斑馬魚癲癇發(fā)作的潛伏期[16]。服用纈草的癲癇患者會有明顯的鎮(zhèn)靜作用，并有更好的抗癲癇治療效果[4]，而且由于其吸收快、不易蓄積的特性，具有較好的安全性。本研究結(jié)果進一步證實了纈草酸的抗驚厥作用，但目前尚無關(guān)于纈草酸抗癲癇機制的研究。

丙戊酸鈉(VPA)是一種有效的AED，成本相對較低，為癲癇治療的重要藥物。在本研究中，我們將纈草酸與VPA聯(lián)合使用以觀察對PTZ癲癇模型小鼠P-GP水平及癲癇發(fā)作的影響。結(jié)果表明，纈草酸和VPA共同給藥可降低大腦皮層P-GP水平，癲癇發(fā)作嚴重程度顯著降低，提示纈草酸可能通過調(diào)節(jié)P-GP表達而增強VPA的抗驚厥作用。

注：與正常對照組比較，***P<0.001；與VPA組比較，#P<0.001，##P<0.001。A：正常對照組；B：模型對照組；C：VPA組；D：低劑量纈草酸+ VPA組；E：中劑量纈草酸+ VPA組；F：高劑量纈草酸+ VPA組。圖3 各組P-GP相對表達量分析Note. Compared with normal control group,***P<0.001.Compared with VPA group,#P<0.05. ##P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F， High dose valeric acid + VPA group.Figure 3 Analysis of relative expression of P-GP in each group

圖5 Tunel檢測各組小鼠神經(jīng)元凋亡Figure 5 Apoptosis examination was performed by Tunel assay

注：與正常對照組比較，***P<0.001；與模型對照組比較，※※P<0.05；與VPA組比較，#P<0.001。A：正常對照組；B：模型對照組；C：VPA組；D：低劑量纈草酸+ VPA組；E：中劑量纈草酸+ VPA組；F：高劑量纈草酸+ VPA組。圖4 各組Cleaved-caspase-3相對表達量分析Note. Compared with normal control group,***P<0.001.Compared with model control group group,※※P<0.05. Compared with VPA group,#P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid + VPA group.Figure 4 Analysis of relative expression of Cleaved-caspase-3 in each group

注：與正常對照組比較，***P<0.001；與模型對照組比較，※※※P<0.05；與VPA組比較，#P<0.001，###P<0.001。A：正常對照組；B：模型對照組；C：VPA組；D：低劑量纈草酸+ VPA組；E：中劑量纈草酸+ VPA組；F：高劑量纈草酸+ VPA組。圖6 各組神經(jīng)元凋亡率分析Note. Compared with normal control group, ***P<0.001.Compared with model control group group, ※※※P<0.05. Compared with VPA group, #P<0.001, ###P<0.001. A, Normal control group. B, Model control group. C, VPA group. D, Low dose valeric acid + VPA group. E, Medium dose valeric acid + VPA group. F, High dose valeric acid + VPA group.Figure 6 Analysis of neuronal apoptosis rate in each group

癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦神經(jīng)元損傷，進而出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，并引起膠質(zhì)細胞增生、突觸重建等腦結(jié)構(gòu)功能變化[8]，細胞凋亡是一個復(fù)雜的生物過程，涉及許多細胞信號通路。Caspase-3是關(guān)鍵的細胞凋亡介體，剪切后的活化形式分子量為17×103的Cleaved-caspase-3[18]，一般是用活性形式說明caspase途徑的激活。我們檢測了Cleaved-caspase-3的表達以明確纈草酸對腦組織的保護作用。結(jié)果表明，纈草酸顯著降低了癲癇小鼠大腦中Cleaved-caspase-3的表達，同時，癲癇小鼠的神經(jīng)元凋亡率也明顯降低，提示纈草酸在減輕癲癇發(fā)作等級的同時，還存在神經(jīng)元的保護作用。

總之，本研究表明，纈草酸聯(lián)合VPA可降低PTZ誘導(dǎo)癲癇小鼠大腦中P-GP的表達并增強VPA的抗驚厥作用。此外，纈草酸還可降低caspase-3活性片段的表達，在癲癇治療過程中對大腦起到潛在保護作用。纈草酸與VPA聯(lián)合治療癲癇可能是一種有效且耐受性良好的治療方案，而纈草酸如何調(diào)控P-GP、凋亡因子及其信號通路機制尚未清楚，有待進一步深入研究。