孫偲豐，王 瑩，楊彥琴，玄基澤，張 斌，秦元華，茅衛(wèi)鋒*

(1.大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物技術系，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤放射治療科，遼寧 大連 116011； 3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科，遼寧 大連 116011； 4.大連醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011； 5.大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院寄生蟲系，遼寧 大連 116044)

乳腺癌是發(fā)生于女性中最惡性的腫瘤之一，每年約有458,000人死于乳腺癌[1-2]。三陰性乳腺癌是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和原癌基因Her-2都為陰性的一種乳腺癌。由于是三陰性，常規(guī)靶向藥物無法對其產(chǎn)生作用，只能按照常規(guī)放化療治療，但這種治療效果較差，伴隨低療效、高復發(fā)的特性。PARP1抑制劑作為一種新型的靶向PARP1的分子靶向藥物，近年來在乳腺癌治療中表現(xiàn)出較好的療效。PARP1是PARP家族的主要成員，其可將ADP-核糖基團轉移至靶蛋白[3-5]。一旦DNA斷裂發(fā)生，PARP1作為單鏈斷裂(SSB)修復中的關鍵因子可以感知損傷并快速結合到斷裂位點并使自身核糖基化，并進一步催化靶蛋白的核糖基化，招募DNA修復蛋白進行DNA修復[6]。因此PARP1抑制劑奧拉帕尼作為抗腫瘤藥物具有良好效果，并已在臨床上用于治療乳腺癌和卵巢癌[7-8]。據(jù)報道，奧拉帕尼可有效抑制BRCA1和PTEN缺陷腫瘤細胞的生長，顯示出PARP1和BRCA1/PTEN的合成致死性。然而，野生型PTEN的腫瘤細胞表現(xiàn)出對PARP1抑制劑的不敏感性[9]，因此，急需要尋找可以增加野生型PTEN腫瘤細胞對奧拉帕尼敏感性的協(xié)同劑。

磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)是位于人類基因組10q23.3上的抑癌基因表達的蛋白，PTEN通過參與PI3K途徑而在細胞增殖中起作用[10-11]。PTEN突變經(jīng)常發(fā)生在各種類型的癌癥中[12-13]。PTEN還促進DNA修復以維持染色體的穩(wěn)定性[14-15]。PTEN能增強腫瘤細胞對化療藥物抗性[16]。PTEN與復制蛋白A1協(xié)同作用，可以保護DNA復制叉并增強RAD51介導的同源重組(HR)。然而，PTEN在DNA修復中的具體作用仍未明確[9,15]。

姜黃素是一種從姜黃根中分離出來的天然化合物，具有抗氧化，抗炎和抗腫瘤活性[17-22]。姜黃素易獲得，價格便宜，常用作膳食調(diào)味品[23-24]。據(jù)報道，姜黃素可抑制不同類型腫瘤細胞的生長，并使癌細胞對阿霉素和5-FU敏感[25]。本研究主要探討了姜黃素對PTEN介導的DNA修復的作用及其潛在機制。這些結果可擴展姜黃素在PTEN野生型三陰性乳腺癌治療中的應用，也可以為異常PTEN腫瘤細胞的個性化治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

人乳腺癌細胞系BT549從美國組織培養(yǎng)物收集中心(ATCC，美國)購得，是PTEN缺陷的三陰性乳腺癌細胞系。細胞在含有10% FBS(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，以色列)，1%青霉素和鏈霉素(Gibico，美國)的RPMI 1640(Hyclone，美國)中培養(yǎng)。本實驗室穩(wěn)轉PTEN基因到BT549中，獲得含PTEN基因的BT549，代表野生型BT549。

1.2 主要試劑

PTEN的抗體(sc-9145)購自Santa Cruz(美國)；β-肌動蛋白(66009-1-1g)、PARP1(13371-1-AP)、微管蛋白(11224-1AP)、RAD51(14961-1-AP)的抗體購自Proteintech(美國)。PARP抑制劑奧拉帕尼(S1060)、姜黃素(S1814)購自Selleck(美國)；苯甲基磺酰氟(PMSF)；蛋白酶抑制劑(B14001，Selleck，美國)；磷酸酶抑制劑(B15001，Selleck，美國)；Fluorometer Qubit 2.0(Invitrogen，美國)；MTT、NaCl、EDTA、Tris、肌氨酸鈉、Trixton X-100、DMSO、NaOH(生工，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質印跡

用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，1×蛋白酶抑制劑和1×磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA緩沖液裂解細胞；Fluorometer Qubit 2.0測定總蛋白濃度；使用10%SDS-PAGE凝膠分離細胞裂解物；將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，使用各種抗體(稀釋比1∶500)檢測蛋白質。

1.3.2 MTT檢測

將細胞(4000個細胞/孔)接種在96孔板中。待細胞貼壁后，加入藥物，與細胞一起溫育48 h。取出藥物，然后將3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)加入96孔板，與細胞一起溫育4 h。除去培養(yǎng)基后加入150 μL的DMSO，492 nm處讀取吸光度。

注：A：通過蛋白質印跡法分別檢測轉染PTEN基因、空載體的BT549細胞中PTEN的表達；B：PTEN細胞和EV(空載體)細胞通過MTT法測定的生長曲線。PTEN：穩(wěn)定轉染PTEN的BT529細胞，EV：轉染空載體的BT549細胞。圖1 PTEN基因的BT529細胞和轉染空載體(EV)的BT549細胞的生長曲線Note. A, Expression of PTEN in BT549 cells transfected with PTEN gene and empty vector was detected by Western blot. B, Growth curves of PTEN cells and EV cells were tested by MTT assay. PTEN, BT529 cells stably transfected with PTEN. EV, BT549 cells transfected with empty vector.Figure 1 Growth curves of PTEN-transfected BT529 cells and empty vector-transfected BT549 cells

1.3.3 彗實實驗

40 μmol/L姜黃素或80 μmol/L奧拉帕尼處理細胞后，取5000個細胞包埋在低熔點瓊脂糖的載玻片上。將載玻片浸入冰冷的裂解緩沖液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris，1%肌氨酸鈉，1% Trixton X-100,10%DMSO)裂解40 min。然后將載玻片放入堿性緩沖液(1 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaOH)中電泳。用溴化乙錠染色后，顯微鏡分析結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PTEN上調(diào)RAD51的表達增強DNA修復

如圖1所示,野生型BT549與BT549的細胞存活曲線(圖1A)顯示兩者間沒有生長差異(圖1B)。

MTT測定顯示EV細胞對奧拉帕尼敏感，而PTEN細胞對奧拉帕尼耐藥。這些結果表明野生型PTEN細胞對新型分子靶向藥物奧拉帕尼耐受(圖2A)。隨后，蛋白質印跡實驗檢測了兩種細胞RAD51的水平(圖2B)，顯示PTEN野生型細胞的RAD51表達更高，表明PTEN增加RAD51介導的同源重組修復以促進DNA修復。

2.2 姜黃素增強奧拉帕尼誘導的DNA斷裂

接下來分析了姜黃素對PTEN促進DNA修復的影響。用奧拉帕尼處理PTEN野生型細胞24 h后，通過彗星試驗檢測DNA斷裂。圖中顯示姜黃素誘導DNA的斷裂。更重要的是，與單種藥物產(chǎn)生的彗尾相比，姜黃素與奧拉帕尼的聯(lián)合使用明顯增加了彗尾(圖3A、3B)。這些結果表明姜黃素促進PTEN野生型細胞中奧拉帕尼誘導的DNA斷裂。

注：A：用不同劑量的奧拉帕尼處理24 h后，與轉染空載體的BT549細胞相比，PTEN細胞具有olaprib抗性；B：蛋白質印跡顯示，與EV細胞中的RAD51水平相比，PTEN上調(diào)RAD51的表達。圖2 PTEN上調(diào)RAD51表達，增強PTEN野生型BT549對PARP1抑制劑奧拉帕尼的耐受Note. A, After treatment with different doses of Olaparib for 24 hours, PTEN cells were resistant to olaprib compared to BT549 cells transfected with an empty vector. B, Western blot shows that PTEN up-regulates RAD51 expression compared to RAD51 levels in EV cells.Figure 2 PTEN upregulates RAD51-mediated resistance of PTEN wild-type BT549 to the PARP1 inhibitor, Olaparib

注： A：用奧拉帕尼或姜黃素處理轉染PTEN的BT549細胞12 h。彗星實驗顯示，40 μmol/L姜黃素增加了彗尾，并促進了奧拉帕尼(80 μmol/L)誘導的PTEN細胞的彗尾；B：分析彗星實驗中的30個彗尾。單因素方差分析和 Turkey’s檢驗，與奧拉帕尼治療組相比，***P <0.001。圖3 姜黃素促進奧拉帕尼處理后的PTEN細胞中的DNA斷裂Note. A, BT549 cells transfected with PTEN were treated with Olaparib or curcumin for 12 hours. The comet assay showed that 40 μmol/L curcumin increased the comet tail and promoted the comet tail of PTEN cells induced by Olaparib (80 μmol/L). B, Analysis of 30 comet tails in comet experiments. One-way analysis of variance and Turkey’s test, compared with the Olaparib treatment group,***P<0.001.Figure 3 Curcumin promotes DNA breaks in PTEN cells treated with Olaparib

2.3 姜黃素降低PTEN乳腺癌細胞中RAD51的表達

隨后分析了姜黃素增強PTEN野生型乳腺癌細胞對奧拉帕尼敏感性的潛在機制。用姜黃素處理后，RAD51水平以劑量依賴性方式降低(圖4)。因此，姜黃素會降低RAD51的表達，從而減輕PTEN介導的DNA修復。此外，我們還發(fā)現(xiàn)姜黃素降低了PARP1的水平，這表明姜黃素可能同樣影響PARP1參與的DNA修復(圖4)。

注：蛋白質印跡結果顯示姜黃素降低了PTEN細胞中Rad51和PARP1的水平。每個Western數(shù)值均由三次實驗完成，其中對照數(shù)值設定為1。Turkey’s檢驗，***P<0.001。圖4 姜黃素降低了PTEN細胞中RAD51的水平Note. Western blot results showed that curcumin reduced the levels of RAD51 and PARP1 in PTEN cells. Each Western value was completed by three experiments. The control value was set 1. Turkey’s test,***P<0.001.Figure 4 Curcumin decreases the levels of RAD51 which is up-regulated in PTEN cells

2.4 姜黃素使PTEN野生型細胞對奧拉帕尼敏感

我們用MTT實驗檢測了姜黃素和奧拉帕尼聯(lián)合處理的PTEN野生型細胞的生長曲線，與單藥奧拉帕尼或姜黃素相比，顯示出姜黃素以劑量依賴性方式使PTEN野生型細胞對奧拉帕尼敏感(圖5A、5B)。這些結果表明，姜黃素與奧拉帕尼聯(lián)合使用時，PTEN野生型癌細胞更加敏感。

注： A：姜黃素單藥處理PTEN細胞與EV細胞后的存活曲線;B：MTT實驗檢測姜黃素與奧拉帕尼聯(lián)合使用后，PTEN細胞的存活曲線。單因素方差分析和Turkey’s檢驗，與奧拉帕尼治療組相比，***P<0.001，**P <0.01，*P <0.05。圖5 姜黃素使轉染PTEN的BT549細胞對奧拉帕尼敏感Note. A, Survival curves of curcumin monotherapy on PTEN cells and EV cells. B, MTT test to detect the survival curve of PTEN cells after curcumin was combined with Olaparib. One-way analysis of variance and Turkey’s test, compared with Olaparib treatment group,***P <0.001,**P <0.01,*P <0.05.Figure 5 Curcumin sensitizes PTEN-transfected BT549 cells to Olaparib

3 討論

PTEN是癌細胞中高度突變的抑癌基因，是癌癥治療的潛在靶標靶標[12]。最近的報道顯示PTEN具有DNA修復能力，使得PTEN野生型腫瘤細胞具有DNA損傷藥物抗性[9,16], 因此研究PTEN引起的腫瘤化療耐藥性具有重要意義。奧拉帕尼是PARP1抑制劑，通過抑制PARP1活性以抑制單鏈斷裂修復[7]。PARP1抑制劑不直接誘導DNA斷裂，因此它具有低毒性并且是有前景的抗腫瘤藥物。奧拉帕尼已被臨床用于治療卵巢癌和乳腺癌。然而，奧拉帕尼的作用依賴于腫瘤細胞的遺傳背景。BRCA異常癌細胞對奧拉帕尼敏感，而BRCA和PTEN野生型細胞對奧拉帕尼耐藥[7]。由于PTEN在DNA修復中的功能尚不清楚，因此很少報道能使PTEN野生型腫瘤細胞敏感的藥物。據(jù)報道RI-1是一種RAD51抑制劑，可增加PTEN腫瘤細胞對順鉑的敏感性。然而，RI-1也不是臨床試劑。此外，抑制RAD51并不能完全降低PTEN的DNA修復能力。

幾個世紀以來，姜黃素一直被用作食用性香料，且在I期人體試驗中，受試者每天使用量高達8000 mg，持續(xù)3個月仍沒有顯示出毒性[23]。據(jù)報道，姜黃素還具有抗腫瘤活性并可抑制多種DNA修復途徑[25]，姜黃素干預N-甲基亞硝基脲誘發(fā)膀胱癌[26]。針對三陰性乳腺癌的耐化療藥物特性[27]，本研究分析了姜黃素對于PTEN的DNA修復能力的影響，同時分析了姜黃素對奧拉帕尼處理PTEN野生型三陰性乳腺癌細胞敏感性的影響。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN促進奧拉帕尼誘導DNA損傷的修復，細胞生長曲線顯示PTEN有助于腫瘤細胞抵抗奧拉帕尼。用姜黃素處理后，彗星實驗顯示PTEN野生型腫瘤細胞中的DNA斷裂增加。MTT實驗顯示姜黃素增加PTEN野生型腫瘤細胞對奧拉帕尼的敏感。我們的研究結果表明，姜黃素可以抑制PTEN促進的DNA修復。

RAD51是HR中的關鍵因子，據(jù)報道，它在PTEN促進DNA的修復中起較為重要的作用[9]。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯降低了RAD51的水平。該結果表明姜黃素干擾RAD51介導的HR并且可以通過降低RAD51水平影響PTEN介導的DNA修復。另外我們還發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯降低了PARP1的水平。PARP1是修飾蛋白質的聚-ADP-核糖基化(PARylation)的酶，可添加的多聚ADP-核糖(PAR)至靶標蛋白進而改變蛋白的電荷從而影響它們與DNA的相互作用[5]. 許多DNA修復因子，如XRCC1，Ku70和DNA-PKcs均是PARP1的靶標。由于PARP1影響DNA修復因子和DNA斷裂位點之間的相互作用，因此PARP1被認為參與多種DNA修復途徑。姜黃素降低PARP1的水平，表明姜黃素除了對RAD51介導的HR有影響外還可以干擾其他DNA修復途徑?？傊?，本文的研究表明姜黃素可以抑制PTEN的DNA修復并使PTEN野生型癌細胞對奧拉帕尼敏感。

綜上所述，這些結果表明姜黃素通過抑制RAD51介導的同源重組達到抑制PTEN的DNA修復能力，從而使PTEN野生型乳腺癌細胞對PARP1抑制劑敏感。這些發(fā)現(xiàn)將促進姜黃素在具有不同基因型PTEN腫瘤細胞的臨床個體化治療中的應用。