董曉筱，李博野，張季瑤，陳 穎，胡 秦*，彭 博*

(1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124； 2.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院， 北京 100124； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100124)

樹突狀細胞(dendritic cells, DC) 由造血干細胞分化，經(jīng)歷前體細胞、未成熟樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞三個階段。機體內(nèi)的DC分布較為廣泛，常定居于脾、淋巴結(jié)、表皮等部位[1]。作為哺乳動物的一種抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)，DC不僅具有攝取、加工、處理及呈遞抗原的能力，同時也可釋放多種細胞因子，提呈抗原并激活初始T細胞，進一步啟動T細胞免疫反應(yīng)[2]，因而在機體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均起著重要的作用。近年來，人們已經(jīng)可以通過使用多種細胞因子，如GM-CSF、IL-4、Flt3等[3]方法來誘導(dǎo)骨髓細胞體外定向分化為骨髓來源的樹突狀細胞(BMDC)，BMDC的體外培養(yǎng)和成熟活化實驗已被廣泛應(yīng)用于佐劑篩選、免疫激活等相關(guān)研究中。

多糖是植物體內(nèi)的一類重要化學(xué)物質(zhì)，不僅在植物體內(nèi)含量較高，而且還具有豐富的生物學(xué)功能。目前，對于植物多糖的研究主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等方面[4-5]。植物多糖具有安全性較高、天然可降解性、免疫原性低、毒副作用小等優(yōu)點。本文選用了靈芝多糖、枸杞多糖、香菇多糖、黃芪多糖、云芝多糖五種粗多糖分別檢測了它們對于BMDC的體外誘導(dǎo)成熟作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠21只，6～8周齡，20～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，實驗動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所[SYXK(京)2016-0021]，嚴格按照中國中醫(yī)科學(xué)院中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所倫理要求進行動物實驗(20190901058)，在實驗研究過程中遵守“3R”原則，并給予實驗小鼠應(yīng)有的人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑

靈芝提取物(生產(chǎn)批號: BCSW20180228-8)；香菇提取物(生產(chǎn)批號: BCSW20180228-8)；枸杞提取物(生產(chǎn)批號: BCSW20180228-8)；云芝提取物(生產(chǎn)批號：BCSW20180228-8)購于西安天象生物工程有限公司，采用熱水浸提、醇沉和酶解工藝進行粗多糖的提取，多糖含量均在50%以上；注射用黃芪多糖購自伯恩公司(生產(chǎn)批號: 151101)。CpG 1668 ODN (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’)由生工生物工程公司合成；RPMI1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；GM-CSF、IL-4購于PeproTech公司；流式抗體APC anti-mouse CD80、PerCp/Cy 5.5 anti-mouse CD40、PE anti-mouse I-A/I-E、FITC anti-mouse CD11c、anti-mouse CD16/32、小鼠IL-6、IL-12p40和TFN-α試劑盒均購自BioLegend公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物粗多糖溶液制備

使用無內(nèi)毒素的水分別溶解枸杞、靈芝、香菇、黃芪和云芝的粗多糖粉末，并調(diào)整濃度為10 mg/mL，通過內(nèi)毒素清除柱(Thermo Scientific)處理后，經(jīng)ToxinSensor終點顯色法內(nèi)毒素檢測試劑盒(Genscript)檢測，內(nèi)毒素含量均在0.05 EU/mL以下。多糖溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，保存于-20℃下備用。

1.3.2 小鼠BMDC細胞培養(yǎng)

取C57BL/6小鼠脫臼處死，無菌分離股骨，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓，1000 r/min離心后重懸于RPMI1640培養(yǎng)基中。細胞懸液以1×106/mL密度接種于6孔板中，加入含GM-CSF(20 ng/mL)的完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基含10%滅活胎牛血清，雙抗及50 μmol/L β-巰基乙醇(SIGMA)。每2 d對細胞進行換液。培養(yǎng)6 d后，收集懸浮或松散貼壁細胞(未成熟BMDC)用于后續(xù)實驗。

1.3.3 流式細胞儀測定細胞表面CD80，CD86和MHCII的表達

未成熟BMDC細胞使用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，接種于24孔板中，分別加入枸杞粗多糖、靈芝粗多糖、香菇粗多糖、黃芪粗多糖和云芝粗多糖，終濃度為100 μg/mL。陰性對照組加入不含藥物的RPMI1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入終濃度為4 μg/mL的CpG 1668 ODN。37°C，80% 濕度，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，1000 r/min離心5 min，收集細胞，經(jīng)anti-mouse CD16/32封閉抗體封閉，冰浴10 min后，加入APC-CD80、Percp/cy 5.5-CD86、PE-MHC II、FITC-CD11c四種抗體于4℃ 避光染色30～40 min。收集細胞，采用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測，通過Flowjo v10軟件分析細胞表面分子表達。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-6，IL-12p40和TFN-α

未成熟BMDC細胞以1×106/mL密度接種于96孔板中，采用不同的粗多糖刺激24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，分別采用小鼠IL-12p40， IL-6和TFN-α檢測試劑盒進行檢測。采用酶標(biāo)儀(PerkinElmer)測定450 nm下的吸光值(OD值)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的細胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 植物粗多糖對BMDC細胞表面分子標(biāo)志表達的影響

采用流式細胞儀檢測粗多糖對BMDC細胞表面CD80和CD86表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組(CC組)相比，陽性對照CpG ODN顯著提高BMDC細胞表面CD80, CD86和MHCII (I-Ab)表達。云芝粗多糖顯著上調(diào)CD86和MHCII (I-Ab)表達，對CD80有一定上調(diào)作用，但無顯著性差異。黃芪粗多糖，枸杞粗多糖，靈芝粗多糖和香菇粗多糖均無明顯作用(如圖1)。結(jié)果表明云芝粗多糖可顯著上調(diào)BMDC細胞表面細胞成熟相關(guān)分子的表達，具有誘導(dǎo)BMDC細胞成熟的作用。

2.2 植物粗多糖對BMDC細胞分泌細胞因子的影響

采用ELISA試劑盒檢測五種植物粗多糖對BMDC細胞培養(yǎng)上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α細胞因子的釋放影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組(CC組)相比，云芝粗多糖培養(yǎng)組和CpG ODN陽性對照組均顯著提升BMDC細胞培養(yǎng)上清中IL-6(P<0.001)，IL-12p40(P<0.05)以及和TFN-α(P<0.001)的含量。枸杞粗多糖(P<0.05)，靈芝粗多糖(P<0.001)和香菇粗多糖(P<0.05)組，BMDC細胞培養(yǎng)上清中IL-6的釋放顯著性提高。其余組均可見不同程度的IL-6，IL-12p40和TFN-α表達上調(diào)，但與對照組相比，無顯著性差異(如圖2所示)。因此，云芝粗多糖可顯著刺激BMDC細胞釋放IL-6，IL-12p40和TFN-α，枸杞粗多糖，靈芝粗多糖和香粗菇多糖可刺激BMDC細胞釋放IL-6。

3 討論

近年來，隨著植物粗多糖藥理學(xué)方面的研究應(yīng)用逐漸深入，植物多糖作為植物中極為重要的成分，其預(yù)防或治療疾病的功能也受到了重視，主要活性包括抗腫瘤、抗病毒、降血脂血糖、抗氧化等[6]，已有文獻證明枸杞多糖、靈芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖等都具有增強機體免疫能力，促進炎癥因子表達，抗病毒、降血糖、誘導(dǎo)體液和細胞免疫應(yīng)答等功能，例如黃芪多糖已被用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等疫苗佐劑[7]；云芝多糖可增強NK細胞的殺傷功能，促進小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞增值，增強腫瘤壞死因子吞噬能力[8-9]；香菇多糖具有抗氧化作用，可以抑制苯并芘誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低皮膚癌風(fēng)險[10]，可對糖尿病大鼠的腦組織起到保護作用[11]；靈芝多糖可激活T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等，促進細胞因子分泌，提高機體的免疫功能[12]。本實驗主要對比了靈芝、香菇、枸杞、黃芪、云芝幾種粗多糖對于BMDC細胞的體外誘導(dǎo)成熟作用，進一步研究其作為佐劑的潛力。

注：A: 五種粗多糖對BMDC細胞表面標(biāo)志物表達的影響；B: CD80的表達；C: CD86的表達；D: I-Ab的表達。與陰性對照組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖1 植物多糖對BMDC細胞表面標(biāo)志分子表達的影響Note. A, Effects of five polysaccharides on BMDC surface marker expression. B, CD80 expression on BMDCs. C, CD86 expression on BMDCs. D, I-Ab expression on BMDCs.**P<0.01,***P<0.001.Figure 1 Effects of plant polysaccharides on BMDC surface marker expression

注：A: IL-6的釋放情況；B: IL-12p40的釋放情況；C: TFN-α的釋放情況。與陰性對照組相比，*P<0.01，***P<0.01。圖2 植物粗多糖對BMDC細胞釋放細胞因子的影響Note. A, Secretion of IL-6. B, Secretion of IL-12p40. C, Secretion of TFN-α. Compared with the CC group, *P<0.01,***P<0.01.Figure 2 Effects of plant polysaccharides on cytokines released by BMDC

DC作為機體內(nèi)最為重要的一種APC，是機體固有免疫的參與者，更是機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)的啟動者[13]。未成熟的樹突狀細胞可以通過多種模式識別受體，如Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)感知抗原，進一步成熟，成熟DC的表面共刺激分子、分泌因子與趨化因子增多[14-15]，除通過MHC-II類分子提成抗原激活CD4+T細胞外，DC還可以通過MHC-I途徑激活CD8+T細胞[16]，更高效全面的發(fā)揮樹突狀細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，因此，DC的活化及數(shù)量都關(guān)系著免疫系統(tǒng)的功能。隨著對DC的研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其在過敏反應(yīng)[17]、感染性休克[18]、抗腫瘤[19]、疫苗佐劑研究等方面都起著至關(guān)重要的作用，已有文獻證明，大多數(shù)腫瘤組織中的DC處于未成熟狀態(tài)，腫瘤細胞誘導(dǎo)DC凋亡，并通過分泌細胞因子抑制DC的產(chǎn)生和成熟[20]，因此，DC的成熟對機體的免疫反應(yīng)起著重要的作用，對DC的誘導(dǎo)成熟也是研究疫苗佐劑的切入點。

本文中以CpG ODN做為陽性對照，使用五種不同的植物粗多糖對BMDC細胞進行體外培養(yǎng)，通過流式細胞術(shù)檢測BMDC細胞表面標(biāo)志分子CD80，CD86和MHCII的表達量的變化及ELISA檢測BMDC細胞上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α的含量。實驗結(jié)果表示，云芝粗多糖與BMDC細胞共培養(yǎng)24 h后，細胞表面CD80，CD86和MHCII的表達量均有上調(diào)，BMDC細胞分泌的IL-6，IL-12p40和TFN-α均有提升。綜上所述，初步分析云芝粗多糖具有誘導(dǎo)BMDC細胞成熟的能力，因此也具有疫苗佐劑的潛在應(yīng)用可能性，值得進一步研究。