李宏睿，張德琴，金曉蕾，唐 驍，王大文，高 雪，辛鵬飛，何進(jìn)程， 麻富斌，周彩云，孫曉瑋*，張建剛*

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所，蘭州 730000； 2.山丹縣人民醫(yī)院內(nèi)科，甘肅 山丹 734100)

隨著生活水平的提高，超重和肥胖的人數(shù)迅速增加，肥胖癥已成為健康的主要危險(xiǎn)因素之一。能量攝入過(guò)多是肥胖發(fā)生的主要原因，作為能量物質(zhì)最終進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境(吸收)的門(mén)戶(hù)和屏障，小腸具有重要的研究?jī)r(jià)值[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道菌群參與營(yíng)養(yǎng)性肥胖的發(fā)生[2-5]。人的腸道內(nèi)有大約10萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，大多分布于結(jié)腸，由于樣本主要從糞便中獲得，目前大多數(shù)研究實(shí)際為結(jié)腸菌群研究[6-8]，然而結(jié)腸糞菌是否能夠反映小腸的菌群特征，反映與吸收功能及營(yíng)養(yǎng)性肥胖的確切關(guān)系，尚缺乏研究。結(jié)腸和小腸菌群差異是營(yíng)養(yǎng)性肥胖發(fā)生的腸道菌群機(jī)制研究要解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題[9]。

本文基于前期建立的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，通過(guò)16S rRNA測(cè)序，對(duì)高脂膳食性大鼠模型回腸和結(jié)腸內(nèi)菌群的微生物多樣性進(jìn)行分析，以明確小腸和結(jié)腸菌群的分布特點(diǎn)及其與營(yíng)養(yǎng)性肥胖發(fā)生的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠43只，4～5周齡，體重(52.32±8.48) g，購(gòu)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SCXK(甘)2018-0002]，。按照實(shí)驗(yàn)要求，為模擬自然狀態(tài)，所有動(dòng)物在蘭州大學(xué)病理學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室普通環(huán)境下單籠飼養(yǎng)[SYXK(甘)2018-0002]，自由進(jìn)食水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定，并獲得蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(jcyxy20190302)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》進(jìn)行，嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的“3R”原則，實(shí)驗(yàn)過(guò)程給予大鼠以人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料按照豬油(lard)∶蛋黃粉(egg yolk powder)∶基礎(chǔ)飼料(chow powder)∶蔗糖(sugar)=1∶1∶1.5∶0.4配制[10]，能量5.58 kcal/g。豬油從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，新鮮煉制；蛋黃粉購(gòu)自北京金健力蛋粉廠(蛋白質(zhì)31.6%，脂肪55.1%，碳水化合物5.3%，巴氏滅菌)；SPF級(jí)基礎(chǔ)飼料(能量3.16 kcal/g)購(gòu)自北京科澳協(xié)力有限公司，60Co 滅菌；蔗糖從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。NucleoSpin 96 Soi DNA提取試劑盒，德國(guó)Macherey Nagel公司； KOD FX Neo DNA聚合酶，日本Toyobo公司；Phusion DNA聚合酶，美國(guó)NEB公司；DNA純化柱，美國(guó)Omega Biotek公司；Monarch DNA膠回收試劑盒，美國(guó)NEB公司。ZK-26/100型真空泵，杭州米歐儀器有限公司；SynergyHTX型酶標(biāo)儀，美國(guó)Gene公司；高速離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司；9902型PCR儀，美國(guó)Allen Bradley公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型建立

動(dòng)物按體重隨機(jī)分為普通飼料組(chow group,n=10)，高脂飼料組(high fat diet, HFD group,n=33)，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，進(jìn)行混合喂養(yǎng)[10]，高脂飼料組同時(shí)飼喂高脂飼料和普通飼料，普通組單純飼喂普通飼料，建立營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型?；旌衔桂B(yǎng)60 d，分別以各組前15%為肥胖傾向(>對(duì)照組平均體重20%, obese prone, HFD-OP,n=5)，以后15%為肥胖抵抗(obesity resistance, HFD-OR,n=5)，再以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)60 d，去除HFD食物本身誘導(dǎo)對(duì)腸道菌群的影響[11-13]。

1.3.2 腸道內(nèi)容物收集

動(dòng)物麻醉后皮膚消毒，無(wú)菌條件下開(kāi)腹，門(mén)靜脈采血處死動(dòng)物，提取回腸及結(jié)腸，分離內(nèi)容物，并立即于冰上分裝至2 mL無(wú)菌EP管中，每管樣品量0.5～2.0 g，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.3.3 微生物多樣性分析

利用Illumina測(cè)序平臺(tái)(百邁客生物科技公司，北京)，采用Illumina HiSeq 2500雙末端測(cè)序(paired-end)檢測(cè)微生物多樣性，測(cè)序長(zhǎng)度350 bp～450 bp。

PCR擴(kuò)增及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建：提取菌群總DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)引物，引物序列如下：338F：5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。引物末端加barcode，對(duì)目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95℃ 5 min→95℃ 30 s→50℃ 30 s→72℃ 40 s 25 cycles→72℃ 7 min→4℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)。

測(cè)序：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢后制備flow cell芯片，Illumina Hiseq 2500雙端測(cè)序，得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads)。

數(shù)據(jù)預(yù)處理：根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將Illumina測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(FLASH, v.1.2.11, JHU Center for Computational Biology)[14]，將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾(Trimmomatic, v.0.33, USADELLAB.org)[15]，去除嵌合體(UCHIME, v.4.2, USEARCH 11)[16]，成一條序列tags。

OTUs(operational taxonomic units)分析：對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Usearch軟件(v.10.0)[17]對(duì)tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)，獲得OTU，一個(gè)OTU代表一個(gè)物種。使用Mothur軟件(version v.1.30, http://mothur.org/)，對(duì)各個(gè)樣品的alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，使用QIIME軟件(v2.2, SCIKIT-BIO, http://qiime.org/)進(jìn)行beta多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。

物種注釋及分類(lèi)學(xué)分析：將OTU的代表序列與Silva微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)(v. 128, http://www.arb-silva.de)[18]進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，應(yīng)用RDP Classifier(v2.2, QIIME)[19]對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。進(jìn)而在門(mén)、綱、目、科、屬、種(phylum, class, order, family, genus, species)各水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類(lèi)水平上的物種豐度表，R語(yǔ)言繪制群落結(jié)構(gòu)圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型

建模60 d，普通飼料組體重為(326.51±29.29) g，高脂飼料組體重為(355.99±36.33) g(P<0.05)。高脂飼料組15%個(gè)體體重(HFD-OP)> 對(duì)照組平均體重20%(5/33)，與普通飼料組及相應(yīng)15%低體重(HFD-OR)(5/33)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，HFD-OR與普通飼料組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

24 h初始進(jìn)食量普通飼料組為(9.23±2.01) g，高脂飼料組為(9.10±1.71) g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。建模期間，普通飼料組進(jìn)食量為(980.00±53.43) g(普通飼料)，高脂飼料組進(jìn)行混合喂養(yǎng)，其中高脂飼料的進(jìn)食量為(630.70±90.61) g，普通飼料的進(jìn)食量為(337.88±82.34) g，高脂飼料與普通飼料的比值為(2.02±0.72)∶1，提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更偏好高脂飼料。

HFD-OP大鼠在高脂飼料、普通飼料的進(jìn)食量以及對(duì)食物的偏好與HFD-OR大鼠無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.2 低能量膳食對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖的影響

經(jīng)普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)60 d，OP大鼠的體重仍然顯著高于OR與普通飼料組，其腎周及睪周脂肪質(zhì)量也顯著高于其它組，P<0.05，見(jiàn)表2。

表1 普通飼料組與高脂飼料組大鼠體重及攝食情況Table 1 Body weight and food intake of rats in chow group and HFD group

2.3 腸道菌群多樣性分析

提取腸內(nèi)容物總DNA，樣品質(zhì)量符合測(cè)序要求，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，得到2489179個(gè)PE reads，經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后共得到2208772個(gè)clean tags。各樣品GC含量為(54.21±0.97)%，Q30達(dá)到(93.96±1.61)%。測(cè)序長(zhǎng)度在406～420 bp之間。

OTU分析：OTU數(shù)反映菌群的多樣性。使用Usearch軟件對(duì)tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得OTU。經(jīng)過(guò)60 d的飼料均一化干預(yù)，高脂飼料組回腸OTU數(shù)與普通飼料組無(wú)明顯差異，但結(jié)腸OTU數(shù)顯著降低，表明高脂膳食引起大鼠結(jié)腸微生物豐度下降，見(jiàn)表3。

不同體重回腸與結(jié)腸OTU數(shù)無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表4。

Alpha多樣性分析回腸、結(jié)腸菌群的OTU，獲得ace、chao1、simpson、shannon指數(shù)，多元多因素方差分析顯示，體重、飼料、部位因素之間無(wú)交互作用(P>0.05，數(shù)據(jù)未提供)，飼料與體重對(duì)alpha多樣性指標(biāo)無(wú)明顯影響(P>0.05，數(shù)據(jù)未提供)，但回腸與結(jié)腸間alpha多樣性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，回腸菌群的chao1、ace指數(shù)均顯著高于結(jié)腸，表明回腸菌群中細(xì)菌數(shù)量(豐度)遠(yuǎn)高于結(jié)腸，而多樣性低于結(jié)腸(simpson、shannon)(P<0.05)(表5)。Venn圖顯示，除普通飼料回腸外，其余組內(nèi)各樣品間OTU具有較大的重疊性，圖1。

2.4 回腸與結(jié)腸菌群beta多樣性分析

應(yīng)用非加權(quán)Binary_Jaccard距離算法比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度，UPGMA聚類(lèi)樹(shù)圖顯示樣品間菌群結(jié)構(gòu)相似，但回腸與結(jié)腸樣品間的相似度較低(圖2)。

表2 低能量膳食對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠體重及內(nèi)臟脂肪的影響Table 2 Effects of low energy diet on body weight and visceral fat of nutritional obese rats

表3 普通飼料組及高脂飼料組回腸、結(jié)腸菌群OTU數(shù)比較Table 3 Comparison of OTUs in ileum and colon of chow group and HFD group

表4 不同體重大鼠回腸、結(jié)腸菌群OTU數(shù)比較Table 4 Comparison of OTUs in ileum and colon of rats with different weights

注：除普通飼料回腸，各組個(gè)體間共有的OTU數(shù)顯著高于個(gè)體特有的OTU數(shù)。圖1 回腸、結(jié)腸細(xì)菌OTU的Venn圖Note. Except for chow-ileum, the number of Common OTUs in each group was significantly higher than that of individual’s specific OTUs.Figure 1 Venn diagram of OTU in ileum and colon

表5 回腸、結(jié)腸菌群alpha多樣性指數(shù)比較

進(jìn)一步采用非度量多維標(biāo)度(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)、主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis, PCoA)和主成分分析(principal component analysis, PCA)，對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析，如圖3所示，結(jié)腸樣本間菌群組成顯示出明顯的相似性，而回腸與結(jié)腸以及回腸樣本間相似度較低。

2.5 物種注釋及分類(lèi)學(xué)分析

將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)Silva進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息。結(jié)果顯示，在屬水平上，回腸與結(jié)腸優(yōu)勢(shì)菌(豐度排名top 10)存在比較大的差異，回腸內(nèi)的主要優(yōu)勢(shì)菌為Romboutsia、Turicibacter、Rothia、Lachnospiraceae、Streptococcus、Candidatus_Arthromitus、Helicobacter、Lactobacillus等，而結(jié)腸的主要優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)achnospiraceae、Treponema、Akkermansia、Candidatus_Saccharimonas、Ruminococcaceae、Romboutsia等，兩者優(yōu)勢(shì)菌的重疊程度較低，見(jiàn)圖4、圖5。

注：B：結(jié)腸；C：回腸。圖2 UPGMA聚類(lèi)樹(shù)圖顯示回腸、結(jié)腸細(xì)菌 結(jié)構(gòu)特征Note. B, Colon. C, Ileum.Figure 2 UPGMA cluster tree showed the structural characteristics of ileum and colon microbiota

HFD大鼠回腸Turicibacter低于普通飼料組，而結(jié)腸內(nèi)的Treponema、Candidatus_saccharimonas低于普通飼料組，證明高脂膳食對(duì)回腸和結(jié)腸菌群的影響不同，并且這種影響具有持久性。

圖3 NMDS、PCA、PCoA分析法顯示回腸、結(jié)腸細(xì)菌結(jié)構(gòu)特征Figure 3 NMDS, PCA and PCoA analyses showed the structural characteristics of ileum and colon microbiota

圖4 回腸內(nèi)細(xì)菌相對(duì)豐度和物種注釋(屬水平)Figure 4 Relative abundance and bacteria annotation in ileum (genus level)

圖5 結(jié)腸內(nèi)菌群相對(duì)豐度和物種注釋(屬水平)Figure 5 Relative abundance and bacteria annotation in colon (genus level)

注：B：結(jié)腸；C：回腸。圖6 HFD-OP回腸、結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌物種豐度聚類(lèi)熱圖(屬水平)Note. B, Colon. C, Ileum.Figure 6 The cluster heat map of bacterial species abundance in the ileum and colon of HFD-OP rats (genus level)

回腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，HFD-OR大鼠回腸內(nèi)Rothia菌豐度明顯增加，而Romboutsia菌豐度降低，提示Rothia菌和Romboutsia菌可能參與回腸吸收的調(diào)節(jié)作用。此外，HFD-OR結(jié)腸內(nèi)Ruminococcaceae_UCG-005顯著增加。

聚類(lèi)分析熱圖顯示HFD-OP大鼠回腸與結(jié)腸內(nèi)菌群類(lèi)型的差異，HFD-OP大鼠回腸內(nèi)Lachnospiraceae、Candidatus_Arthromitus、Helicobacter、Lactobacillus較其它處理組豐度低，而Turicibacter、Romboutsia、Streptococcus、Rothia的豐度較高。與其它各組相比，結(jié)腸內(nèi)菌群除與其它各組相同的優(yōu)勢(shì)菌群外，Prevotella_9、Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度較高，而Candidatus_Saccharimonas、Lactobacillus、uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae豐度較低，圖6。

3 討論

營(yíng)養(yǎng)性肥胖是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，腸道作為能量物質(zhì)最終進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境的門(mén)戶(hù)和屏障，其內(nèi)大量定居的菌群被認(rèn)為在肥胖的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[20]。腸道菌群作為機(jī)體重要的共生生命，與食物成分及消化道的功能相互協(xié)同，形成一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，在消化、營(yíng)養(yǎng)、免疫等方面發(fā)揮重要生理功能，若其構(gòu)成改變也會(huì)導(dǎo)致心、腦等器官發(fā)生多種嚴(yán)重疾病[21-23]。哺乳動(dòng)物腸道微生物數(shù)量存在縱向變化，例如在人的消化道內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[24]，胃、小腸近端、回腸、結(jié)腸中每毫升內(nèi)容物的細(xì)菌數(shù)量分別為102～103、103～105、108、1011。結(jié)腸是機(jī)體最大的食物殘?jiān)纸鈭?chǎng)所，長(zhǎng)期以來(lái)，腸道菌群的研究主要集中在結(jié)腸，那么結(jié)腸糞菌能否代表小腸菌群？本研究表明，盡管回腸與結(jié)腸之間菌落的OTU數(shù)差異不明顯，并且多數(shù)菌群存在重疊(Venn圖)，但alpha多樣性分析顯示回腸菌群的樣品內(nèi)物種豐度顯著高于結(jié)腸(chao1、ace)，而多樣性低于結(jié)腸(simpson、shannon)；beta多樣性分析顯示結(jié)腸樣本間菌群組成具有明顯的相似性，而回腸與結(jié)腸以及回腸樣本間相似度較低；經(jīng)注釋分析，兩者的優(yōu)勢(shì)菌群存在明顯的不同，并且重疊程度較低；聚類(lèi)分析熱圖也顯示回腸與結(jié)腸內(nèi)的菌群物種豐度分布不同，表明結(jié)腸內(nèi)的糞菌并不能代表回腸內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)。因此，在腸道菌群研究中必須注意這一問(wèn)題，這與Leite等[25]對(duì)人、Grond等[26]對(duì)濱鳥(niǎo)、Su等[27]對(duì)蒙古馬的研究結(jié)果相一致。

小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，研究結(jié)論顯示，腸道菌群通過(guò)多種機(jī)制參與肥胖的發(fā)生，包括LPS誘導(dǎo)的腸滲漏和炎癥[28]，慢性低度內(nèi)毒素[29]、腸源性肽激素[30]、脂肪組織活性成分等的調(diào)節(jié)[31]，包括GPCR、AMPK信號(hào)途徑影響能量平衡和飽食感，以及短鏈脂肪酸影響脂類(lèi)和能量物質(zhì)代謝[32]等，但多數(shù)研究是基于結(jié)腸糞菌探討與肥胖的關(guān)系，還不足以揭示小腸菌群調(diào)節(jié)吸收促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)性肥胖發(fā)生的機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，回腸內(nèi)的主要優(yōu)勢(shì)菌為Romboutsia、Turicibacter、Rothia、Lachnospiraceae、Streptococcus、Candidatus_Arthromitus、Helicobacter、Lactobacillus等，而結(jié)腸的主要優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)achnospiraceae、Treponema、Akkermansia、Candidatus_Saccharimonas、Ruminococcaceae、Romboutsia等，提示回腸與結(jié)腸菌群存在功能的差異，小腸菌群和糞菌可能具有不同的功能屬性。

OTU是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的指標(biāo)，不容易受到營(yíng)養(yǎng)程度的影響，但本研究表明，高脂膳食可能對(duì)結(jié)腸的OTU數(shù)存在比較持久的影響，物種注釋顯示高脂膳食對(duì)回腸、結(jié)腸內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌也具有持久的影響。我們發(fā)現(xiàn)，Turicibacter、Rothia、Romboutsia、Streptococcus可能參與回腸吸收的調(diào)節(jié)，在營(yíng)養(yǎng)性肥胖的發(fā)生中發(fā)揮一定的作用，對(duì)于這一結(jié)果，還需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究支持。

腸道菌群研究是一個(gè)非常復(fù)雜的領(lǐng)域，一方面由于腸道微生物組成在個(gè)體間具有很大的差異，而且不同背景(飲食習(xí)慣和種族)的參與者構(gòu)成及用于分析細(xì)菌的不同方法在很大程度上都會(huì)影響研究結(jié)果的統(tǒng)一；另一方面則因?yàn)榧膊?dòng)物模型在腸道微生物群組成、發(fā)酵過(guò)程、進(jìn)食習(xí)慣等方面存在差異[33]。本文在營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型的基礎(chǔ)上，研究腸道菌群與肥胖發(fā)生的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)結(jié)腸與回腸具有不同的菌群特征，對(duì)于探尋人類(lèi)腸道菌群促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)性肥胖發(fā)生的機(jī)制具有較好的借鑒價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)高脂膳食性營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠回腸和結(jié)腸菌群進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析，證實(shí)回腸與結(jié)腸具有不同的腸道菌群，結(jié)腸菌群并不能代表回腸的菌群特征，腸道的部位是進(jìn)行腸道菌群研究必須要考慮的因素；Turicibacter菌、Rothia菌、Romboutsia菌、Streptococcus菌可能是參與肥胖發(fā)生的關(guān)鍵回腸固有菌群。