王靜，趙怡然，劉曉佳，田中燕

唐山市婦幼保健院，河北唐山063000

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的，以氣道慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[1]，是兒童呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。近年隨著環(huán)境污染加重，我國(guó)兒童哮喘的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。由于兒童家長(zhǎng)對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)不足、臨床醫(yī)師的規(guī)范化管理水平參差不齊，我國(guó)兒童哮喘的總體控制水平尚不理想[2]。外泌體是直徑30～200 nm的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)微小囊泡，能夠攜帶多種蛋白質(zhì)、脂類和核酸，可作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞，從而改變其他細(xì)胞的功能，在免疫監(jiān)視﹑炎癥反應(yīng)及腫瘤分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理和病理生理過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)可參與氣道變應(yīng)性炎癥的發(fā)病過程，并且哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中外泌體所包含的miRNA表型與健康人明顯不同[5-6]。因此，外泌體miRNA有可能成為哮喘潛在的非侵入性分子生物標(biāo)志物。微小RNA-7b(miR-7b)是最新發(fā)現(xiàn)的miRNA，定位于11號(hào)染色體，能夠參與急性肺損傷炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)和修復(fù)過程，其機(jī)制可能與抑制IL-12表達(dá)、促進(jìn)TNF-α表達(dá)有關(guān)[7-8]。因此，miR-7b被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子。但目前外周血外泌體中miR-7b表達(dá)與兒童哮喘的關(guān)系尚不清楚。本研究觀察了哮喘患兒血清外泌體中miR-7b表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1—12月唐山市婦幼保健院收治的哮喘患兒48例(觀察組)。所有患兒入院時(shí)處于急性發(fā)作期，入院后經(jīng)吸入性糖皮質(zhì)激素聯(lián)合長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑規(guī)范治療進(jìn)入臨床緩解期。哮喘診斷和分期依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡4～12歲；③初診；④臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他呼吸系統(tǒng)疾病者；②合并先天性氣道疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者。同期選擇因其他疾病在唐山市婦幼保健院住院的患兒48例(對(duì)照組)，排除有過敏性疾病史或哮喘家族史者，有反復(fù)呼吸道感染史者以及入組前1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)呼吸道感染者。觀察組男30例、女18例，年齡(8.9±2.7)歲；對(duì)照組男29例、女19例，年齡(8.8±2.3)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)唐山市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 血清外泌體中miR-7b表達(dá)檢測(cè) 觀察組分別于入院次日和臨床緩解1個(gè)月后，對(duì)照組于入院次日，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，1 500 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血清，-80 ℃保存。取部分血清，采用外泌體RNA分離試劑盒(exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit)提取血清外泌體及其RNA。提取外泌體RNA后，按Thermo ScientificTMRevertAidTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-7b上游引物5′-AACCCGUAGAUCUUGGAUCCUG-3′，下游引物5′-CAACAUCAUCUACGGUUUGGGU-3′；β-actin上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。PCR擴(kuò)增體系共25 μL：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL，上下游引物各1 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，93 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-7b相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 血清IFN-γ、IL-4檢測(cè) 取上述-80 ℃保存的血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4，檢測(cè)儀器為Stat-fax-2100酶標(biāo)儀。ELISA試劑盒均購(gòu)自上海優(yōu)爾生科技股份有限公司。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。血清IFN-γ、IL-4水平的最低檢測(cè)值均為0.5 ng/mL，IFN-γ ELISA試劑盒的組間和組內(nèi)變異系數(shù)分別為3.5%、5.5%，IL-4 ELISA試劑盒的組間和組內(nèi)變異系數(shù)分別為4.5%、6.5%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清外泌體中miR-7b表達(dá)及血清IFN-γ、IL-4水平比較 見表1。

表1 兩組血清外泌體中miR-7b表達(dá)及血清IFN-γ和IL-4水平比較

2.2 急性發(fā)作期哮喘患兒血清外泌體中miR-7b表達(dá)及血清IFN-γ、IL-4水平的關(guān)系 急性發(fā)作期哮喘患兒血清外泌體中miR-7b表達(dá)與血清IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.36，P<0.01)，與血清IL-4水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.69，P<0.01)，而血清IFN-γ水平與血清IL-4水平無明顯相關(guān)性(r=0.51，P>0.05)。見圖1A～C。

圖1 急性發(fā)作期哮喘患兒血清外泌體中miR-7b表達(dá)及血清IFN-γ、IL-4水平的關(guān)系

2.3 血清外泌體中miR-7b表達(dá)對(duì)兒童哮喘的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清外泌體中miR-7b表達(dá)診斷兒童哮喘的曲線下面積(AUC)為0.858(95%CI：0.749～0.907)，其截?cái)嘀禐?.81，此時(shí)其診斷兒童哮喘的敏感度為81.9%、特異度為87.3%，見圖2；血清外泌體中miR-7b表達(dá)用于鑒別兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUC為0.801(95%CI：0.733～0.889)，其截?cái)嘀禐?.27，此時(shí)其鑒別兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的敏感度為74.5%、特異度為72.9%，見圖3。

圖2 血清外泌體中miR-7b表達(dá)診斷兒童哮喘的ROC曲線

圖3 血清外泌體中miR-7b表達(dá)鑒別兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的ROC曲線

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道，我國(guó)兒童哮喘患病率在以每10年增加50%以上的幅度上升；及時(shí)診斷并接受規(guī)范化治療是控制兒童哮喘最有效的方式[10-11]。哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的異質(zhì)性疾病，Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡在哮喘發(fā)病過程中起重要作用。Th1、Th2型細(xì)胞因子分別由Th1、Th2型細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，IL-12可刺激并誘導(dǎo)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ能夠刺激Th1、Th2型細(xì)胞因子分泌，從而形成一個(gè)正向反饋，進(jìn)而抑制哮喘氣道炎癥和浸潤(rùn)過程[12]。因此，深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制對(duì)提高哮喘患兒的診治水平具有重要意義。

外泌體可由機(jī)體內(nèi)包括免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌，其囊泡內(nèi)含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸成分。外泌體不僅是一種穩(wěn)定有效的細(xì)胞間信號(hào)傳遞和交換遞質(zhì)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞和器官功能。外周血循環(huán)中的核酸序列，由于容易受到核酶及外源性物質(zhì)的影響和干擾，不容易穩(wěn)定存在于外周血循環(huán)中。相對(duì)于外周血循環(huán)中不穩(wěn)定的核酸序列，外泌體中的核酸序列具有高度穩(wěn)定性且較少受到循環(huán)中其他來源的核酸序列干擾，被認(rèn)為是疾病診斷的一種理想生物標(biāo)志物[13-14]。有研究報(bào)道，外泌體亦參與哮喘的發(fā)病過程。過敏性哮喘患者痰液外泌體中RNA，包括miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其表達(dá)在過敏原刺激前后可發(fā)生明顯變化，提示外泌體中RNA是一種潛在的哮喘診斷生物標(biāo)志物[15]。miR-7b是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一。有研究報(bào)道，miR-7b能夠參與肺部炎癥反應(yīng)的損傷和修復(fù)過程，其作用是通過降低IL-12表達(dá)和促進(jìn)TNF-α表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[8]，而IL-12、TNF-α在哮喘發(fā)病過程中具有重要作用。因此推測(cè)，血清外泌體中miR-7b可能參與哮喘的發(fā)病過程。但目前相關(guān)報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，觀察組急性發(fā)作期和臨床緩解期血清外泌體中miR-7b相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，并且觀察組急性發(fā)作期血清外泌體中miR-7b相對(duì)表達(dá)量高于臨床緩解期，提示miR-7b可能參與哮喘的發(fā)病過程。目前認(rèn)為，Th1/Th2型細(xì)胞因子比例失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組急性發(fā)作期和臨床緩解期血清IFN-γ水平均低于對(duì)照組，血清IL-4水平均高于對(duì)照組，但觀察組急性發(fā)作期血清IFN-γ水平低于臨床緩解期，血清IL-4水平高于臨床緩解期。提示無論是在哮喘急性發(fā)作期還是臨床緩解期，血清中由Th1型細(xì)胞分泌的IFN-γ減少，而由Th2型細(xì)胞分泌的IL-4增多，即在外周血循環(huán)中存在Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡。TIAN等[17]報(bào)道，與臨床緩解期比較，急性發(fā)作期哮喘患者血清miR-1和IFN-γ水平明顯降低，而血清IL-4水平明顯升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期哮喘患兒血清外泌體中miR-7b相對(duì)表達(dá)量與血清IL-4水平呈正相關(guān)關(guān)系，與血清IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而血清IFN-γ水平與血清IL-4水平無明顯相關(guān)性。提示血清外泌體中miR-7b表達(dá)能夠反映血清IL-4、IFN-γ水平，miR-7b有可能通過調(diào)節(jié)與Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡相關(guān)的IFN-γ、IL-4水平參與哮喘的發(fā)病過程。

有研究報(bào)道，血漿外泌體中miR-125b表達(dá)能夠用于哮喘診斷和病情程度鑒別[18]。由此推測(cè)，外周血中外泌體miRNA對(duì)哮喘診斷和鑒別診斷具有較好的臨床價(jià)值。本研究評(píng)估了血清外泌體中miR-7b表達(dá)對(duì)兒童哮喘診斷和鑒別診斷的效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清外泌體中miR-7b表達(dá)診斷兒童哮喘的AUC為0.858，其敏感度為81.9%、特異度為87.3%；而血清外泌體中miR-7b表達(dá)用于鑒別兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUC為0.801，其敏感度為78.5%、特異度為74.9%。提示血清外泌體中miR-7b表達(dá)亦能用于兒童哮喘診斷和鑒別診斷，有望成為兒童哮喘輔助診斷的一種生物標(biāo)志物。

綜上所述，哮喘患兒血清外泌體中miR-7b表達(dá)升高，并與血清IFN-γ、IL-4水平存在一定相關(guān)性；血清外泌體中miR-7b表達(dá)可作為兒童哮喘診斷或鑒別診斷的生物學(xué)指標(biāo)。