李敏，趙妍麗，杜國波

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000

宮頸癌是女性第四大常見惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約52.8萬例，死亡達(dá)26.6萬例[1]。隨著宮頸癌篩查手段和技術(shù)不斷提高，部分患者能夠得以早期診斷和治療，但在中低收入國家宮頸癌的發(fā)病率和病死率仍然較高[2]。目前，宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制尚不明確。因此，深入探索與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的分子，尋找潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)無蛋白編碼功能的非編碼RNA分子有可能通過調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，有望成為疾病的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)FOXD2-AS1基因定位于人染色體1p33，是一種與惡性腫瘤相關(guān)的lncRNA。lncRNA FOXD2-AS1通過與其他非編碼RNA分子結(jié)合，從而對基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，繼而參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化及物質(zhì)代謝等過程[4]。近年有研究報道，lncRNA FOXD2-AS1在喉癌、食管癌組織中均存在異常表達(dá)現(xiàn)象；lncRNA FOXD2-AS1可能通過影響β-鈣黏素、Akt、E2F轉(zhuǎn)錄因子1等下游癌基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖和遷移[5-6]。miR-506-5p編碼基因定位于人染色體Xq27.3，其能與下游基因信使RNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，通過改變信使RNA的穩(wěn)定性而調(diào)控基因的表達(dá)，繼而影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程[7]。LI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-5p具有抑癌基因作用，其在乳腺癌、肺癌組織中低表達(dá)，通過上調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞周期素激酶4、Ras，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展。但目前l(fā)ncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系尚不清楚。2015年4月—2016年4月，本研究分析了宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)變化并探討其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以同期川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院診治的91例宮頸癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷為宮頸癌；②接受根治性子宮切除術(shù)或改良根治性子宮切除術(shù)；③入院前未行放化療、免疫或生物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他宮頸疾病者；②既往有其他器官或系統(tǒng)腫瘤史者；③伴心、肺、腎等臟器功能衰竭者?；颊吣挲g30～72(45.2±7.1)歲，其中≥45歲42例、<45歲49例；病理類型：腺癌13例，鱗癌78例；FIGO分期[9]：Ⅰ、Ⅱ期50例，Ⅲ期41例；組織分化程度：低分化31例，高中分化60例；浸潤深度：深肌層52例，淺肌層39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有53例，無38例。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審核，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)檢測 取宮頸癌組織與癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>2 cm且經(jīng)組織病理檢查明確為正常宮頸組織)，-80 ℃冰箱保存。待組織成批后，分別取50 mg，TRIzol法提取總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度、純度和完整性符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由北京睿博科技有限公司設(shè)計合成。lncRNA FOXD2-AS1上游引物5′-AATGGACAGAAGCTATCCAGGC-3′、下游引物5′-AGTTGAAGGTGCACACACTG-3′，miR-506-5p上游引物5′-CCTTGGCACCCTTCTGTAGA-3′、下游引物5′-TGATGGGTTGTAGAGGCATCC-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-GCGAGATCGCACTCATCATCT-3′、下游引物3′-TCAGTGGTGGACCTGACC-5′。lncRNA FOXD2-AS1 PCR擴(kuò)增體系20 μL：SYBR Green preMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 20 s共40個循環(huán)。miR-506-5p PCR擴(kuò)增體系20 μL：SYBR Green preMix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件93 ℃ 15 min，93 ℃ 30 s、58 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s共40個循環(huán)。收集各樣本閾值循環(huán)數(shù)(CT)值。以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 以獲得病理診斷結(jié)果作為隨訪起點(diǎn)，隨訪方式采取門診復(fù)查形式，每3個月隨訪1次，隨訪截至2019年4月。以隨訪期間患者死亡或至隨訪截至?xí)r間為隨訪終點(diǎn)，統(tǒng)計患者生存情況。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)比較 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA FOXD2-AS1相對表達(dá)量分別為1.117±0.305、0.924±0.297，miR-506-5p相對表達(dá)量分別為1.213±0.311、1.742±0.321。與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)升高，miR-506-5p表達(dá)降低(t分別為4.325、11.291，P均<0.01)。

2.2 宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)與miR-506-5p表達(dá)的關(guān)系 相關(guān)分析顯示，宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)與miR-506-5p表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.621，P<0.01)。

2.3 宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 所有患者隨訪3～48個月，中位隨訪時間31.3個月，隨訪期間死亡34例。以宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1相對表達(dá)量的平均數(shù)(1.101)為截斷值，將患者分為lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)者46例、lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)者45例。lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)者3年總生存率為34.6%(15/46)，lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)者為82.5%(37/45)。lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)者3年總生存率低于lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)者(χ2=22.864，P<0.05)。見圖1a。

以宮頸癌組織miR-506-5p相對表達(dá)量的平均數(shù)(1.245)為截斷值，將患者分為miR-506-5p高表達(dá)者47例、miR-506-5p低表達(dá)者44例。miR-506-5p高表達(dá)者3年總生存率為78.7%(37/47)，miR-506-5p低表達(dá)者3年總生存率為34.1%(15/44)。miR-506-5p高表達(dá)者3年總生存率高于miR-506-5p低表達(dá)者(χ2=18.485，P<0.05)。見圖1b。

圖1 宮頸癌組織不同lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)者的生存曲線

3 討論

我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13.2萬例，死亡達(dá)5.3萬例，已成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅我國女性健康的重要疾病之一[10]。宮頸癌早期通過手術(shù)、放化療等手段即可獲得良好的治療效果，但對于局部晚期或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者，治療效果較差。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，靶向治療逐漸應(yīng)用于臨床并初見成效。但由于宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制目前還不清楚。因此，探索宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價值。

lncRNA是由200～300個核苷酸組成的單鏈RNA分子，能夠與蛋白質(zhì)、非編碼RNA等結(jié)合形成復(fù)合物，使特定的基因激活或失活，或通過分子支架結(jié)合細(xì)胞內(nèi)其他分子，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，繼而參與個體發(fā)育、衰老等生物學(xué)過程。有研究報道，lncRNA異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)。lncRNA FOXD2-AS1的編碼基因位于人染色體1p33。CHEN等[11]研究報道，lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，lncRNA FOXD2-AS1可通過影響下游癌基因表達(dá)，如β-鈣黏素、Akt、E2F1等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)明顯上調(diào)，表明lncRNA FOXD2-AS1可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。目前l(fā)ncRNA FOXD2-AS1的促癌機(jī)制尚不清楚，可能與促進(jìn)lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)升高有關(guān)。有研究報道，lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)受E2F1調(diào)控，E2F1能夠結(jié)合到lncRNA FOXD2-AS1的啟動子區(qū)域，并促進(jìn)其表達(dá)[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)與腫瘤FIGO分期、組織分化程度有關(guān)，表明lncRNA FOXD2-AS1異常表達(dá)能夠參與宮頸癌的惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能是lncRNA FOXD2-AS1參與活化Notch信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，而敲除lncRNA FOXD2-AS1后腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)者3年總生存率低于lncRNA FOXD2-AS1低表達(dá)者。提示lncRNA FOXD2-AS1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致宮頸癌患者預(yù)后不良，有希望成為預(yù)測患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

miRNA是一類長度為19～23個核苷酸的非編碼RNA分子，在結(jié)構(gòu)上具有典型的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡等生物學(xué)過程。miRNA基因首先在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄為初始miRNA，進(jìn)而在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成miRNA前體，然后在Dicer酶的作用下轉(zhuǎn)化為成熟miRNA，通過形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物與靶基因信使RNA特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中存在多種miRNA異常表達(dá)現(xiàn)象，并且相同的miRNA在不同腫瘤組織中發(fā)揮的生物學(xué)作用可能不同[5-7]。miR-506-5p的編碼基因定位于人染色體Xq27.3。有研究表明，miR-506-5p在乳腺癌、肺癌組織中低表達(dá)；在體外基礎(chǔ)研究中證實(shí)，上調(diào)miR-506-5p表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為[8]。因此，miR-506-5p可作為一種抑癌基因，其在腫瘤組織中低表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌和肺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-506-5p表達(dá)降低，表明miR-506-5p可能參與宮頸癌的發(fā)病，其機(jī)制與腫瘤發(fā)生時miR-506-5p基因的啟動子區(qū)域甲基化沉默有關(guān)。有研究報道，miR-506-5p在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，其啟動子區(qū)的表觀遺傳學(xué)修飾導(dǎo)致其表達(dá)顯著降低，而其下游癌基因表達(dá)則顯著升高[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期高、組織分化程度低的宮頸癌患者腫瘤組織miR-506-5p表達(dá)較低。提示miR-506-5p異常低表達(dá)與宮頸癌的惡性進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制可能是腫瘤發(fā)生時miR-506-5p表達(dá)降低，導(dǎo)致CDK4表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖的潛能[15]。本研究分析了miR-506-5p表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-506-5p低表達(dá)的宮頸癌患者3年總生存率較低，提示miR-506-5p低表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。早期檢測宮頸癌組織miR-506-5p表達(dá)有助于判斷患者預(yù)后。

王婷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FOXD2-AS1能夠作為分子支架結(jié)合miR-506-5p并抑制miR-506-5p表達(dá)和生物學(xué)功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，繼而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1表達(dá)與miR-506-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在宮頸癌中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1可能通過負(fù)向調(diào)控miR-506-5p參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1高表達(dá)、miR-506-5p低表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；宮頸癌組織lncRNA FOXD2-AS1、miR-506-5p表達(dá)與腫瘤FIGO分期、組織分化程度和患者預(yù)后有關(guān)，但二者能否成為宮頸癌早期診斷的生物標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)仍需深入研究。