田姍，曹霞，李翔，李曾

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院，陜西漢中732000

肺癌是臨床常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，全球每年新增病例達(dá)180萬例，死亡約160萬例[1]。根據(jù)其組織病理學(xué)主要分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌兩類，其中85%～90%為NSCLC[2]。大多數(shù)NSCLC患者確診時已處于中晚期，錯過了根治性手術(shù)的最佳時機(jī)，以鉑類為主的化療成為其主要治療手段[3]，但患者預(yù)后并不理想，5年生存率不足15%[4-5]。隨著分子細(xì)胞水平研究的深入，相繼有靶向藥物問世，為中晚期惡性腫瘤患者帶來了福音。但靶向藥物價格普遍昂貴，超出了普通家庭的支付能力。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多天然化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，如小檗堿、姜黃素、鴉膽子素D等[6-8]。鴉膽子素D是從鴉膽子果實中提取的一種水溶性三環(huán)四萜類化合物。鴉膽子素D與紫杉醇聯(lián)用能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[9]。鴉膽子素D亦可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[10]。但目前鴉膽子素D對NSCLC的作用報道較少。2018年12月—2020年5月，本研究探討了鴉膽子素D對NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、PC9、H1975、H460(以下分別稱A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞)，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。鴉膽子素D，純度>98%(HPLC)，規(guī)格20毫克/支，購自上海盛中醫(yī)藥化工有限公司。將鴉膽子素D用DMSO溶解后配制成1 mmol/L母液分裝，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Multiskan FC酶標(biāo)儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；FACScan流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司；Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)，購自美國GE公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。JNK、p-JNK、β-actin一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，購自美國Cell Singnaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 取A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞，接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合90%左右時，用含EDTA的0.25%胰酶消化，按1∶4傳代。

1.3 NSCLC細(xì)胞和鴉膽子素D濃度篩選 取傳4代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的NSCLC細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并計數(shù)，以2×103個/孔接種于96孔板，每孔200 μL，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別加入100、200、300、400、500 μmol/L鴉膽子素D 10 μL，使鴉膽子素D終濃度分別為5、10、15、20、25 μmol/L，每個濃度設(shè)6個平行孔。同時，設(shè)置陰性對照組和空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，直至結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的光密(OD)值，計算細(xì)胞存活率和鴉膽子素D的50%抑制濃度(IC50)。細(xì)胞存活率=(藥物干預(yù)組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。根據(jù)IC50選擇對鴉膽子素D敏感度適中的NSCLC細(xì)胞和接近IC50時的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞周期檢測 采用PI染色法。取上述篩選的NSCLC細(xì)胞6×105個，置于6 mL培養(yǎng)液中混勻。取細(xì)胞懸液1 mL，接種于6孔板，隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組設(shè)3個平行孔，然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去舊培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；1 000 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的無水乙醇1 mL，使乙醇的終濃度為70%，4 ℃固定24 h。收集細(xì)胞，分別加入含50 mg/mL PI、100 mg/mL RNase A的染色液500 μL，常溫避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。采用ModFit LT軟件分析細(xì)胞周期中G1、S、G2/M期細(xì)胞比例。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。取上述篩選的NSCLC細(xì)胞6×105個，置于6 mL培養(yǎng)液中混勻。取細(xì)胞懸液1 mL，接種于6孔板，隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組設(shè)3個平行孔，然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去舊培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；1 000 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL重懸細(xì)胞，然后分別加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 JNK信號通路蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取上述篩選的NSCLC細(xì)胞4×105個，接種至培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為觀察組和對照組，每組設(shè)3個平行培養(yǎng)皿，然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去舊培養(yǎng)液，對照組加入新鮮培養(yǎng)液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集兩組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液1 mL，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。然后加入1×loading buffer緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE分離蛋白(5%濃縮膠、15%分離膠)，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入JNK、p-JNK、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(稀釋比1∶4 000)，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC細(xì)胞和鴉膽子素D濃度篩選結(jié)果 隨著鴉膽子素D濃度升高，A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞存活率逐漸降低，呈濃度依賴性(F分別為42.214、36.251、45.014、65.204，P均<0.01)，見表1。鴉膽子素D對A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞的IC50分別為19.81、18.98、15.51、10.62 μmol/L。A549、PC96、H1975、H460細(xì)胞對鴉膽子素D的敏感度依次增強(qiáng)，故選擇敏感度適中的PC9、H1975細(xì)胞，以15 μmol/L鴉膽子素D進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度鴉膽子素D干預(yù)下4種NSCLC細(xì)胞存活率變化

2.2 PC9、H1975細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D干預(yù)后細(xì)胞周期變化 見表2、3。

表2 PC9細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D干預(yù)后細(xì)胞周期變化

2.3 PC9、H1975細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D干預(yù)后細(xì)胞凋亡率變化 PC9細(xì)胞：觀察組細(xì)胞凋亡率為(46.2±5.9)%，對照組為(5.5±1.3)%，觀察組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(t=11.652，P<0.01)。H1975細(xì)胞：觀察組細(xì)胞凋亡率為(53.2±4.8)%，對照組為(4.5±1.1)%，觀察組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(t=16.861，P<0.01)。

表3 H1975細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D干預(yù)后細(xì)胞周期變化

2.4 PC9、H1975細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D干預(yù)后JNK信號通路蛋白表達(dá)變化 PC9細(xì)胞：觀察組JNK蛋白相對表達(dá)量為0.97±0.08，p-JNK蛋白相對表達(dá)量為0.21±0.03，對照組分別為0.96±0.10、0.92±0.14；觀察組p-JNK蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組(t=21.352，P<0.01)，兩組JNK蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.032，P>0.05)。H1975細(xì)胞：觀察組JNK蛋白相對表達(dá)量為0.87±0.04，p-JNK蛋白相對表達(dá)量為0.15±0.02，對照組分別為0.89±0.06、0.87±0.09；觀察組p-JNK蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組(t=19.254，P<0.01)，兩組JNK蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.962，P>0.05)。

3 討論

目前，臨床對于中晚期NSCLC主要采取以化療為主的綜合治療。常用的化療藥物為細(xì)胞毒類，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但同時也會損害機(jī)體快速增殖的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞，從而抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多天然化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。這些天然化合物配合化療藥物治療惡性腫瘤，不僅能提升化療藥物的抗腫瘤效果，還能減輕其毒副反應(yīng)，成為近年來研究的熱點(diǎn)。

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實。鴉膽子成熟的種子是一種傳統(tǒng)中藥，被收錄于2015版《中國藥典》，用來治療痢疾、瘧疾、雞眼等。梁子寧等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子提取物對口腔念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用。楊丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳劑能夠使高脂血癥沙鼠血清膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性顯著增強(qiáng)，心肌和肝臟的脂蛋白脂肪酶活性亦顯著升高，提示鴉膽子油乳劑具有明顯的調(diào)脂作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子還具有一定的抗腫瘤活性[13]。鴉膽子素D是從鴉膽子成熟果實中分離出的一種水溶性三環(huán)四萜類化合物，該化合物具有高效的抗胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌活性[14-15]。但目前鴉膽子素D對NSCLC的作用報道較少。本研究結(jié)果顯示，鴉膽子素D在體外對NSCLC細(xì)胞具有一定的抗腫瘤活性，在一定濃度范圍內(nèi)鴉膽子素D(5～25 μmol/L)對A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性，并且A549、PC9、H1975、H460細(xì)胞對鴉膽子素D的敏感度依次增強(qiáng)。在后續(xù)研究中，選擇敏感度適中的PC9、H1975細(xì)胞，以15 μmol/L鴉膽子素D進(jìn)行實驗。

細(xì)胞周期特異性藥物主要?dú)幱谠鲋持芷诘哪[瘤細(xì)胞，能夠通過將細(xì)胞阻滯于某一時期進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。為了探究鴉膽子素D是否具有阻斷細(xì)胞周期的作用，我們觀察了15 μmol/L鴉膽子素D對PC9、H1975細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是PC9細(xì)胞還是H1975細(xì)胞，觀察組G1期細(xì)胞比例均低于對照組，G2/M期細(xì)胞比例均高于對照組，表明鴉膽子素D可阻滯PC9、H1975細(xì)胞于G2/M期，延長細(xì)胞增殖周期，抑制NSCLC細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是PC9細(xì)胞還是H1975細(xì)胞，觀察組細(xì)胞凋亡率均高于對照組，表明鴉膽子素D可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡。JNK是絲裂原活化蛋白激酶的主要成員，JNK信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。BAI等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族6可通過調(diào)節(jié)MAP4K1/JNK信號通路的傳導(dǎo)影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能。TAN等[17]研究報道，丁氨酸D可通過調(diào)節(jié)JNK信號通路誘導(dǎo)人NSCLC細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是PC9細(xì)胞還是H1975細(xì)胞，觀察組p-JNK蛋白相對表達(dá)量均低于對照組，而兩組JNK蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示鴉膽子素D可能是通過抑制JNK信號通路傳導(dǎo)，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，鴉膽子素D可能通過抑制JNK信號通路傳導(dǎo)，抑制NSCLC細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。