韓麗麗,李明嫻,尹鳳先,丁艷艷

1 首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院,北京102600;2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院

據(jù)統(tǒng)計，慢性阻塞性肺疾病(COPD)在全球死亡原因中居第四位，隨著人口老齡化加劇和環(huán)境污染加重，其發(fā)病率仍在逐年上升[1-2]。目前，治療COPD的藥物以吸入性糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)，地塞米松是其常用藥物，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性[3]。迄今為止，COPD患者地塞米松耐藥的機制尚不完全清楚[4]。黏蛋白1(MUC1)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)氣道上皮細胞的抗炎癥反應(yīng)。有研究報道，MUC1缺失能夠加重COPD患者支氣管上皮屏障破壞[5-6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，對皮質(zhì)類固醇激素耐藥的慢性鼻竇炎患者MUC1表達下調(diào)[7]。由此推測，MUC1有可能成為預(yù)測激素耐藥的潛在生物標(biāo)志物。但目前尚無直接證據(jù)表明COPD患者地塞米松耐藥與MUC1表達缺失有關(guān)。2019年5月—2020年5月，本研究探討了人支氣管上皮細胞地塞米松耐藥與MUC1表達的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常支氣管上皮細胞NHBE(以下稱NHBE細胞)，購自美國ATCC細胞庫。所有引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。地塞米松，購自美國Sigma公司。Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。IL-8、粒細胞—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) ELISA檢測試劑盒，購自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.2 香煙煙霧提取物(CSE)制備 設(shè)計CSE裝置，該裝置由一大一小兩個玻璃瓶經(jīng)橡膠管連接而成。大玻璃瓶有兩個開口，一個開口直通空氣，另一個開口通過橡膠管連接于裝有20 mL新鮮PBS的小玻璃瓶。小玻璃瓶通過橡膠管連接吸引器。在大玻璃瓶內(nèi)點燃1支未去過濾嘴的香煙(紅梅牌84 mm烤煙型香煙)，通過吸引器持續(xù)吸引，一共抽吸2支，抽吸時間5 min。將吸入的香煙煙霧通過橡膠管溶于20 mL PBS制成懸液，調(diào)整懸液pH為7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即為100% CSE原液，其余濃度的CSE用PBS稀釋制成10%、25%、50% CSE溶液，分裝后凍存于-80 ℃冰箱。

1.3 細胞活力檢測 采用MTT法。將NHBE細胞以2×103個/孔接種于96孔板，用200 μL含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別向96孔板中加入10%、25%、50%、100% CSE溶液20 μL，使CSE終濃度分別為1%、2.5%、5%、10%，另設(shè)陰性對照孔(不加入CSE)和空白對照孔(不加入NHBE細胞)。然后將96孔板置于恒溫箱孵育48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，恒溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO溶液150 μL，輕輕振蕩混勻。酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 炎癥因子IL-8、GM-CSF檢測 將NHBE細胞接種于培養(yǎng)瓶中，用4 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，分別加入10%、25%、50%、100% CSE溶液400 μL，使CSE終濃度分別為1%、2.5%、5%、10%。干預(yù)48 h，收集各濃度CSE干預(yù)后的培養(yǎng)上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液炎癥因子IL-8、GM-CSF。檢測儀器為Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，所有操作嚴(yán)格按IL-8、GM-CSF ELISA試劑盒說明進行。從1%、2.5%、5%、10% CSE中，選擇引起NHBE細胞炎癥因子分泌增加的最小濃度進行后續(xù)實驗。

1.5 地塞米松耐藥NHBE細胞構(gòu)建 取NHBE細胞4×105個，接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，加入1×10-7mol/L地塞米松200 μL，使地塞米松終濃度為1×10-8mol/L，每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)液。持續(xù)培養(yǎng)1個月，收集細胞，設(shè)為耐藥細胞組，加入適量CSE溶液和地塞米松，使CSE終濃度達到上述篩選的最小濃度、地塞米松終濃度達到1×10-8mol/L。另取NHBE細胞，隨機分為非耐藥細胞1組和非耐藥細胞2組，非耐藥細胞1組加入適量CSE溶液，使CSE終濃度達到上述篩選的最小濃度；非耐藥細胞2組加入適量地塞米松，使地塞米松終濃度達到1×10-8mol/L。各組干預(yù)48 h，收集培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液炎癥因子IL-8、GM-CSF。檢測儀器為Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀，所有操作嚴(yán)格按IL-8、GM-CSF ELISA試劑盒說明進行。

1.6 MUC1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取耐藥細胞組、非耐藥細胞1組和非耐藥細胞2組干預(yù)48 h細胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS中和消化，用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫落。將細胞懸液收集于離心管中，1 500 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，收集細胞沉淀。采用TRIzol法提取細胞總RNA，經(jīng)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。按cDNA合成試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將所得cDNA加入100 μL DEPC水稀釋，按TB Green Premix Ex Taq Ⅱ說明進行PCR擴增。引物序列：MUC1上游引物5′-AATGAATGGCTCAAAACTTGG-3′，下游引物5′-CAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG-3′；U6上游引物5′-TCGTCCTCATACTGCTCA-3′，下游引物5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min循環(huán)3次，94 ℃ 5 s、55 ℃ 5 s、70 ℃ 5 s循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細胞活力比較 0、1%、2.5%、5%、10% CSE干預(yù)后，NHBE細胞存活率分別為(100.0±3.4)%、(98.5±3.0)%、(97.4±3.6)%、(95.2±3.1)%、(85.6±2.5)%。隨著CSE濃度升高，NHBE細胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性(F=8.520，P<0.01)。5%、10% CSE干預(yù)后NHBE細胞存活率明顯低于0、1%、2.5% CSE干預(yù)后，并且10% CSE干預(yù)后NHBE細胞存活率低于5% CSE干預(yù)后(P均<0.05)。而0、1%、2.5% CSE干預(yù)后NHBE細胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細胞分泌炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較 見表1。結(jié)果提示，引起炎癥因子IL-8、GM-CSF水平增加的CSE最小濃度為5%，故選擇5% CSE進行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度CSE干預(yù)后NHBE細胞分泌IL-8、GM-CS水平比較

2.3 地塞米松耐藥NHBE細胞鑒定 各組炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較見表2。結(jié)果提示，耐藥細胞組地塞米松抑制NHBE細胞炎癥因子IL-8、GM-CSF分泌的作用消失，表明地塞米松耐藥NHBE細胞構(gòu)建成功。

表2 各組炎癥因子IL-8、GM-CSF水平比較

2.4 各組MUC1 mRNA表達比較 非耐藥細胞1組、非耐藥細胞2組、耐藥細胞組干預(yù)48 h MUC1 mRNA相對表達量分別為40.5±5.7、39.2±4.7、15.6±3.1。耐藥細胞組MUC1 mRNA相對表達量均低于非耐藥細胞1組和非耐藥細胞2組(t分別為15.201、14.305，P均<0.01)，而非耐藥細胞1組與非耐藥細胞2組MUC1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.302，P>0.05)。

3 討論

目前，治療COPD的藥物以吸入性糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)，地塞米松是其常用藥物。大部分COPD患者低劑量吸入地塞米松就能很好地控制癥狀，但部分患者需要更高劑量甚至口服才能達到最佳控制效果，表明這部分COPD患者對地塞米松的抗炎作用出現(xiàn)了抵抗。地塞米松耐藥是COPD治療過程中的常見問題，但目前對其耐藥機制尚不完全清楚，可能與糖皮質(zhì)激素受體磷酸化修飾改變、組蛋白脫氧酶2活性喪失等有關(guān)[4]。因此，深入探索地塞米松的耐藥機制，對尋找其潛在的生物標(biāo)志物或研發(fā)新的靶向藥物具有重要意義[8]。

MUC1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，廣泛存在于呼吸道、胃腸道等上皮細胞以及各種免疫相關(guān)細胞表面[9]。以往MUC1通常作為一種腫瘤相關(guān)分子被研究，其在多數(shù)惡性腫瘤組織中過表達或異常糖基化[10]。有研究認(rèn)為，MUC1、E-cadherin和PINCH三者相互作用共同影響非小細胞肺癌細胞間的黏附性并促進其惡性進展[11]。MUC1基因沉默可抑制肝癌細胞增殖和侵襲，其機制可能與調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1、c-Myc和MMP-9表達有關(guān)[12]。MUC1與卵巢癌組織病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。在皮質(zhì)類固醇激素療效喪失的分子機制中，被分析最多的是磷脂酰肌醇3-激酶活化、組蛋白去乙酰化酶2活性喪失以及糖皮質(zhì)激素受體對NF-κB的抑制作用等[4]，尚無證據(jù)表明其與MUC1表達變化有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，MUC1是一種重要的內(nèi)源性抗炎分子，在急性肺部感染中能夠促進炎癥消退[14]。但其具體作用機制尚不明確。

COPD的主要特征是肺部異常炎癥反應(yīng)，這種炎癥持續(xù)存在通常與吸入有害氣體或顆粒有關(guān)，而最常接觸到的有害氣體是香煙煙霧。香煙煙霧能夠激活上皮細胞分泌炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF和IL-8。本研究選擇GM-CSF、IL-8這兩種炎癥因子。在研究過程中，首先制備CSE并刺激支氣管上皮細胞，從而模擬COPD的炎癥反應(yīng)，根據(jù)CSE對NHBE細胞活力和對炎癥因子GM-CSF、IL-8分泌的影響，確定以5% CSE進行后續(xù)實驗。本研究結(jié)果顯示，1×10-8mol/L地塞米松與5% CSE共同干預(yù)能夠明顯抑制NHBE細胞炎癥因子GM-CSF、IL-8分泌，提示1×10-8mol/L地塞米松對炎癥反應(yīng)具有明顯抑制作用。而1×10-8mol/L地塞米松持續(xù)干預(yù)NHBE細胞1個月，其抑制NHBE細胞炎癥因子分泌的作用明顯減弱，表明NHBE細胞對地塞米松已產(chǎn)生耐藥性。進一步觀察了NHBE細胞地塞米松耐藥與MUC1表達的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地塞米松耐藥的NHBE細胞MUC1 mRNA相對表達量明顯降低，由此推測NHBE細胞地塞米松耐藥可能與MUC1表達降低有關(guān)。

綜上所述，人支氣管上皮細胞地塞米松耐藥可能與MUC1表達降低有關(guān)。