呂召坤 ，玉一嵐 ，李蘭英，張德春

（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002）

稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)于確保國民糧食安全和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。水稻（Oryza sativa）是世界主要糧食作物之一，全世界有接近一半的人口以稻米為主食。雖然水稻半矮桿基因的發(fā)掘和應(yīng)用以及雜種優(yōu)勢的利用使得水稻產(chǎn)量取得了巨大的飛躍[1]，然而，面對(duì)世界人口的持續(xù)增長（預(yù)計(jì)2050 年將達(dá)到90 億）[2]，水稻育種家和植物遺傳學(xué)家需要進(jìn)一步提高水稻的產(chǎn)量。

水稻產(chǎn)量是一種多性狀共同決定的復(fù)雜農(nóng)藝性狀，主要受有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重三因素制約[3]。有效穗數(shù)在很大程度上取決于單株分枝數(shù)、分蘗角度和株高；每穗粒數(shù)主要取決于穗部結(jié)構(gòu)，如穗長、每穗分枝數(shù)、籽粒密度和育性；而千粒重直接受到籽粒的形狀和大小的影響[4]。此外，粒形也是評(píng)價(jià)稻米品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，印度、越南和美國偏愛細(xì)長型稻米，而中國東北、韓國和日本更喜歡短圓型稻米[5]。因此，剖析稻米粒形的遺傳基礎(chǔ)對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

粒形可以劃分為粒長、粒寬、粒厚三個(gè)不同的影響因子，且三者都是由多基因控制的數(shù)量性狀[6]。揭示水稻粒長、粒寬和粒厚的分子遺傳機(jī)理，對(duì)于全面解析控制粒形性狀的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和挖掘可利用的優(yōu)異育種基因資源具有重要意義。因此，尋找并克隆控制相應(yīng)性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait loci, QTL）及剖析相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)是研究粒形的重要途徑。目前，在水稻12 條染色體上檢測到與粒形相關(guān)的QTL 已經(jīng)超過600 個(gè)，其中93 個(gè)已被成功克隆并進(jìn)行了功能分析[7-8]。它們通過不同的信號(hào)途徑調(diào)控水稻粒形的發(fā)育，主要包括泛素—蛋白酶體途徑、G 蛋白信號(hào)途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑、MAPK 信號(hào)途徑以及植物激素調(diào)控途徑。GW2 和GW5 通過泛素—蛋白酶體途徑調(diào)控水稻籽粒大小。GW2編碼一個(gè)E3 泛素連接酶，通過降解促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白酶負(fù)調(diào)控水稻穎殼大小，進(jìn)而影響籽粒大小[9]。GW5編碼的蛋白質(zhì)與多聚泛素有相互作用，通過泛素—蛋白酶體途徑調(diào)控籽粒穎殼的細(xì)胞分裂數(shù)目對(duì)籽粒大小進(jìn)行調(diào)控[10-11]。GS3和DEP1通過G 蛋白信號(hào)途徑參與稻米粒形的調(diào)控。GS3編碼一個(gè)由5 個(gè)外顯子組成的Gγ 亞基，它的功能缺失會(huì)導(dǎo)致籽粒明顯變??；而DEP1是一種功能獲得性突變基因，功能獲得性突變dep1能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，并使穗粒數(shù)增加，促進(jìn)水稻增產(chǎn)[12-14]。GLW7、GW8、LGY3等在轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子途徑中參與水稻粒形的調(diào)控，GW8和GLW7的編碼蛋白都是調(diào)控粒形的正向調(diào)控因子，其高表達(dá)水平能夠促進(jìn)穎殼細(xì)胞分裂，導(dǎo)致籽粒變大，LGY3編碼的轉(zhuǎn)錄因子在第7 內(nèi)含子和第8 外顯子的連接區(qū)發(fā)生突變，產(chǎn)生一個(gè)新的可變剪切位點(diǎn)，導(dǎo)致籽粒變長[15-17]。SMG1編碼一個(gè)絲裂原活化蛋白激酶MAPK4，通過MAPK 信號(hào)途徑調(diào)控籽粒形狀；而GS2/GL2參與了植物激素油菜素內(nèi)酯調(diào)控途徑[18-21]。雖然這些基因部分解析了調(diào)控稻米粒形的分子機(jī)理，但這對(duì)于了解水稻粒形遺傳網(wǎng)絡(luò)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控粒形的QTL 位點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)制更有利于全面闡述整個(gè)遺傳網(wǎng)絡(luò)，為今后水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的提高提供遺傳基礎(chǔ)。

在本研究中，矮桿小粒突變體dsg1(dwarf and short grain)是由TB309 經(jīng)甲基磺酸乙酯(thymethylsulfone，EMS，體積比為0.8%)溶液誘變后篩選得到的。通過對(duì)dsg1進(jìn)行表型和農(nóng)藝性狀考察，發(fā)現(xiàn)粒寬、粒厚和千粒重顯著降低，并且穗長和地上部節(jié)間距也顯著縮短。對(duì)候選基因進(jìn)行精細(xì)定位，將突變基因dsg1定位于水稻第4 號(hào)染色體，位于分子標(biāo)記ID2798 與ID2803 之間的52.28 kb 區(qū)間內(nèi)，并利用Gramene 數(shù)據(jù)庫在該定位區(qū)間找到11 個(gè)候選基因，為dsg1基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

dsg1突變體由TB309 經(jīng)EMS 誘變獲得，經(jīng)連續(xù)多年自交已穩(wěn)定遺傳。dsg1與9311 雜交后構(gòu)建F2分離群體進(jìn)行基因定位。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要農(nóng)藝性狀考察 將實(shí)驗(yàn)材料TB309、突變體dsg1、9311 和F2群體種植于湖南寧鄉(xiāng)關(guān)山和海南三亞水稻田，單株種植，行距為26 cm，株距為16 cm，大田常規(guī)管理。在水稻成熟期進(jìn)行株高測量，分別測100 株；并測定莖稈的節(jié)間長度，測10 個(gè)重復(fù)。種子成熟后，單株收取各家系植株，用恒溫干燥箱60 ℃烘烤直至籽粒重量恒重為止。利用游標(biāo)卡尺對(duì)實(shí)驗(yàn)材料TB309、突變體dsg1、9311 和F2群體的成熟種子進(jìn)行粒長、粒寬和粒厚等指標(biāo)的測定，每個(gè)性狀測10 個(gè)重復(fù)。將TB309 和dsg1植株的整個(gè)穗子取回，測量其穗長、千粒重、結(jié)實(shí)率等性狀，每個(gè)性狀測10 個(gè)重復(fù)[22]。

1.2.2 遺傳分析 以秈稻9311 和突變體dsg1為親本，經(jīng)過雜交后自交得到由68 個(gè)單株組成的F2群體，對(duì)F2群體的粒形分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行卡方測驗(yàn)。

1.2.3 基因定位 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的存在于水稻12條染色體上的Indel 引物，篩選在dsg1和9311 兩親本間存在多態(tài)性的引物。從dsg1/9311 的F2分離群體挑選10 株極端矮化小粒的單株和10 株極端長粒表型的單株，采用極端個(gè)體法進(jìn)行連鎖分析。利用均勻分布于12 條染色體的171 對(duì)有多態(tài)性的分子標(biāo)記擴(kuò)增極端個(gè)體的DNA，用3%的瓊脂凝膠進(jìn)行檢測，并做好數(shù)據(jù)記錄[23]。使用作圖軟件MAPMAKER(EXP3.0b)構(gòu)建突變基因所在范圍的分子標(biāo)記連鎖圖譜，將突變基因定位在一條染色體上的兩個(gè)標(biāo)記之間，完成初定位。初定位后，擴(kuò)大F2群體，同時(shí)使用16 個(gè)具有多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行候選基因的精細(xì)定位，并繪制突變基因所在位置的遺傳圖譜。精細(xì)定位所用引物序列見表1。

1.2.4 BR 激素敏感性實(shí)驗(yàn) 將去殼的飽滿水稻種子經(jīng)75%乙醇和5%次氯酸鈉消毒處理后，在無菌條件下分別播種至含有表油菜素內(nèi)酯（EpiBL）和不含EpiBL 的1/2 MS 固體培養(yǎng)基，生長8 d 后，觀察根長生長情況，記錄數(shù)據(jù)[24]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算、顯著性差異分析、卡平方測驗(yàn)均用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行。根據(jù)x2的數(shù)值和自由度得到概率值，以P=0.05 為適合性測驗(yàn)符合的下限。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體dsg1 的表型分析

在自然生長條件下，對(duì)dsg1與TB309 進(jìn)行表型考察。利用t測驗(yàn)對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示：與野生型相比，突變體dsg1表現(xiàn)出明顯的矮桿表型（表2，圖1a），其株高約為TB309 的79.00%，倒一節(jié)、倒二節(jié)、倒三節(jié)和穗長的長度顯著低于TB309（表2，圖1b、圖1d）。與TB309 相比，dsg1的籽粒出現(xiàn)明顯的小粒表型，粒長、粒寬、粒厚分別減小15.53%、7.26%和10.45%，千粒重降低了34.14%（表2，圖1c）。另外，與野生型相比，dsg1分蘗數(shù)也顯著減少，單株總產(chǎn)量顯著降低。

表1 本研究使用的引物Table 1 The primers used for this study

表2 野生型TB309 與突變體dsg1 的表型鑒定Table 2 Comparison of agronomic trait of the wild type TB309 and the dsg1 plants

2.2 油菜素內(nèi)酯激素敏感性分析

由于突變體不僅在粒形性狀上發(fā)生改變，在植株高度、分蘗數(shù)目、節(jié)間長度和稻穗長度等方面也表現(xiàn)出顯著性變化，這與先前報(bào)道的油菜素內(nèi)酯的合成或代謝缺陷表型相似[25-26]，因此，我們猜測dsg1突變體可能與BR 激素有關(guān)。為了驗(yàn)證這個(gè)猜測，我們對(duì)野生型TB309 和突變體dsg1進(jìn)行了BR激素響應(yīng)的敏感性實(shí)驗(yàn)。我們通過外施EpiBL 的方式檢測DSG1是否參與BR 響應(yīng)。在施加EpiBL 培養(yǎng)后，野生型TB309 的主根長度明顯縮短，說明外源施加EpiBL 抑制了根部的伸長；然而突變體dsg1的主根長度并沒有顯著性變化（圖2a, 圖2b）。由此表明，dsg1并不是一個(gè)BR 合成缺陷突變體，而有可能是BR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中出現(xiàn)缺陷導(dǎo)致了突變。

圖1 野生型TB309 與突變體dsg1 的表型鑒定Fig. 1 Phenotypic identification of the wild type TB309 and the dsg1 mutant

圖2 突變體dsg1 對(duì)BR 響應(yīng)敏感性Fig. 2 Mutant dsg1 as a BR-insensitive mutant

2.3 遺傳分析

為了克隆該突變體的基因，把粒長作為目標(biāo)性狀對(duì)DSG1 進(jìn)行遺傳效應(yīng)分析和精細(xì)定位研究。我們將dsg1與9311 進(jìn)行雜交，得到F1代植株，其表型與9311 表型相似。將F1代自交獲得F2群體，在F2群體中出現(xiàn)9311 粒長表型和突變體小粒表型分離，說明該突變表型是由隱性基因控制的。統(tǒng)計(jì)F2群體中粒長表型的單株數(shù)量，發(fā)現(xiàn)粒長表型頻率呈現(xiàn)雙峰分布（圖3），表明存在主效QTL。在F2群體中，長粒和短粒表型數(shù)目分別為42 和26,。對(duì)粒長表型進(jìn)行x2測驗(yàn)，兩種表型在F2群體中的分離比符合3 ∶1（x2=0.16，x20.05=3.84，df=1），符合孟德爾遺傳規(guī)律，表明該dsg1的粒長性狀受單基因控制。

圖3 F2 群體粒長性狀頻率分布Fig. 3 Frequency distribution of grain length in a F2 population

2.4 基因定位

將dsg1與9311 進(jìn)行雜交，在F2分離群體中分別選取10 株極端小粒表型單株和極端長粒表型的單株，利用均勻分布于12 條染色體的Indel 分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，將DSG1基因初定位于第4 染色體標(biāo)記ID2610 和ID3004 之間。為了進(jìn)一步對(duì)候選QTL 進(jìn)行精細(xì)定位，在初定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)14 對(duì)新的多態(tài)性分子標(biāo)記，利用交換單株縮小定位區(qū)間，最終將突變基因定位在分子標(biāo)記ID2798 與ID2803的區(qū)間內(nèi)，物理距離約為52.28 kb，其間包含11 個(gè)候選基因（圖4）。

圖4 水稻突變體dsg1 的基因定位Fig. 4 Fine mapping of rice mutant dsg1 gene

表3 定位區(qū)間內(nèi)的候選基因注釋Table 3 Annotation of DSG1 candidate genes in the location interval

2.5 候選基因的預(yù)測及分析

根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu)提供的基因注釋信息，在52.28 kb 候選區(qū)間內(nèi)存在11 個(gè)注釋基因（表3）。其中3 個(gè)編碼表達(dá)蛋白，2 個(gè)功能未知蛋白，其余分別編碼轉(zhuǎn)座蛋白、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、跨膜蛋白、含有DUF630/DUF632 域的蛋白、含有激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白和生長調(diào)控相關(guān)蛋白。通過Gramene 網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間內(nèi)存在3 個(gè)可能與水稻株高、穗型和粒性發(fā)育相關(guān)的基因。LOC_Os04g47480預(yù)測結(jié)果顯示，其編碼蛋白可能含有DUF630/DUF632 結(jié)構(gòu)域。未知功能結(jié)構(gòu)域蛋白家族(domains of unknown function protein families, DUFs)是一類進(jìn)化保守且有功能的蛋白家族，其不同成員參與不同的生長發(fā)育過程及脅迫響應(yīng)[27]。含有DUF630/DUF632 結(jié)構(gòu)域的蛋白參與了葉片形態(tài)建成，進(jìn)而導(dǎo)致了稻米籽粒大小的變化。LOC_Os04g47570的表達(dá)蛋白含有激酶結(jié)構(gòu)域，其同源基因LOC_Os03g40400 的表達(dá)產(chǎn)物參與了GS3 和qGL3 調(diào)控稻米籽粒大小的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其表達(dá)水平上調(diào)了1.5 倍，該基因的表達(dá)可能會(huì)影響稻米籽粒的大小[28]。LOC_Os04g47510 在水稻中有一個(gè)同源基因LOC_Os07g27670，該基因的編碼蛋白是WRKY 家族中的一員。WRKY 家族蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與并調(diào)控植物生長發(fā)育、形態(tài)建成和各種生物或非生物脅迫反應(yīng)[29]。WRKY 蛋白能夠與生長素（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）以及油菜素內(nèi)酯（BR）等多種植物激素相互作用調(diào)控植物生長發(fā)育[30-31]。在擬南芥中，WRKY46、WRKY54 和WRKY70 能促進(jìn)與BR 相關(guān)的生長基因表達(dá)并抑制抗旱基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)擬南芥生長[32]。在蘋果中，轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY9 直接抑制油菜素類固醇限制合成酶MdDWF4 的轉(zhuǎn)錄，減少BR 產(chǎn)生，調(diào)控植株高度[33]。在水稻中，OsWRKY53 能夠正向調(diào)控BR信號(hào)進(jìn)而調(diào)控水稻葉片角度及籽粒大小，其過表達(dá)植株的葉角增加，稻米籽粒變大；而OsWRKY78的RNAi 植株可能由于細(xì)胞長度的縮減而表現(xiàn)出半矮化和小籽粒的表型[34-35]。因此，這3 個(gè)基因都有可能是DSG1的候選基因。

3 討論

水稻粒形是重要的農(nóng)藝性狀之一，對(duì)水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)起到重要作用，是多基因、多途徑調(diào)控的復(fù)雜遺傳性狀，也是分子設(shè)計(jì)育種的主要性狀之一[36]。分子設(shè)計(jì)育種是在解析作物重要農(nóng)藝性狀遺傳機(jī)理的基礎(chǔ)上，通過品種設(shè)計(jì)對(duì)復(fù)雜性狀進(jìn)行定向改良，達(dá)到聚合優(yōu)異性狀的目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)作物復(fù)雜性狀的精準(zhǔn)改良[37]。實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種的難點(diǎn)在于調(diào)控目標(biāo)性狀的遺傳網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，所以，分子設(shè)計(jì)育種的前提和要求是對(duì)目標(biāo)性狀的分子機(jī)理和遺傳基礎(chǔ)有較為深刻的理解。雖然在水稻中已克隆93個(gè)與粒型相關(guān)的QTL，然而，可應(yīng)用于分子設(shè)計(jì)育種的控制稻米籽粒的基因非常有限。利用Ghd7不同等位基因之間地理分布不同的特點(diǎn)，Ghd7在不同生態(tài)區(qū)的水稻生育期改良中得到了高效利用，獲得了生育期改良的新品系[38]。Wang 等將GW8和GW7導(dǎo)入我國高產(chǎn)水稻品種，在不減產(chǎn)的基礎(chǔ)上提升稻米品質(zhì)[39]。還有研究表明，將GS3、DPE1、qSW5、SD1、Ghd7、Ghd8和Wx等基因聚合獲得的改良品種與超級(jí)雜交稻“兩優(yōu)培九”相比，該新品種表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量潛力和更好的籽粒品質(zhì)[40]。所以，隨著分子設(shè)計(jì)育種構(gòu)想的發(fā)展，需要挖掘更多的粒形相關(guān)基因。在本研究中，我們利用EMS 誘變粳稻品種TB309，篩選得到遺傳性狀穩(wěn)定的矮桿小粒突變體dsg1，并將其定位于第4 染色體分子標(biāo)記ID2798 與ID2803 之間52.28 kb 的區(qū)間內(nèi)，以期克隆到相關(guān)基因，以便應(yīng)用于分子設(shè)計(jì)育種。

此外，我們發(fā)現(xiàn)dsg1突變體不僅粒形性狀發(fā)生顯著性變化，而且株高、穗長、分蘗數(shù)目和節(jié)間長度等其他農(nóng)藝性狀也呈現(xiàn)顯著性減小，說明該基因能夠控制多種不同的表型，這可能與“一因多效”有關(guān)。一因多效是自然界中廣泛存在的現(xiàn)象，其概念最早是由孟德爾所提出的，用來描述一個(gè)單獨(dú)的基因或位點(diǎn)影響兩個(gè)或兩個(gè)以上不同性狀的現(xiàn)象[41]。例如，GS3編碼的Gγ 亞基，可通過G 蛋白信號(hào)途徑調(diào)控稻米粒長和粒重，同時(shí)對(duì)粒寬和粒厚也具有微效作用[15]；DEP1不僅能夠調(diào)控粒長和千粒重，還對(duì)穗長、每穗實(shí)粒數(shù)、耐旱性等其他性狀有影響[42]；WTG1同時(shí)控制每穗粒數(shù)和分蘗數(shù)目2 種不同的性狀[43-44]；Ghd7同時(shí)調(diào)控水稻抽穗期、每穗粒數(shù)和株高3 種性狀，猜測可能是抽穗期延遲增加了穗部和秸稈等器官的發(fā)育進(jìn)程從而使產(chǎn)量增加和植株變高[39]。同樣，DSG1可能能夠影響不同的生化代謝途徑，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而影響多種農(nóng)藝性狀。本研究完成了對(duì)該基因的精細(xì)定位，并通過基因注釋信息分析和激素敏感性實(shí)驗(yàn)得到3個(gè)可能是DSG1的候選基因，為進(jìn)一步克隆該基因并剖析其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于利用分子設(shè)計(jì)育種的方法改善稻米產(chǎn)量和品質(zhì)也具有重要意義。

4 結(jié)論

1）本研究利用EMS 技術(shù)誘變粳稻品種TB309獲得了一個(gè)矮桿小粒的突變體dwarf and short grain(dsg1)。與野生型相比，突變體dsg1的株高、粒長、粒寬、粒厚和千粒重顯著降低，并且突變體的穗長和節(jié)間距也顯著縮短。

2）通過植物激素敏感性實(shí)驗(yàn)證實(shí)dsg1有可能是BR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中出現(xiàn)缺陷導(dǎo)致了突變，而不是BR 合成缺陷突變體。在施加EpiBL 培養(yǎng)后，野生型TB309 的主根長度明顯縮短，但是突變體dsg1的主根長度并沒有顯著性變化。

3）對(duì)突變體dsg1與9311 雜交獲得的F2群體進(jìn)行表型考察和遺傳分析，F(xiàn)2代出現(xiàn)表型分離，且符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明該粒長突變基因是由隱性單基因控制。

4）通過精細(xì)定位，將突變基因定位于水稻第4染色體分子標(biāo)記ID2798 與ID2803 之間52.28 kb 的區(qū)間內(nèi)，并利用Gramene 數(shù)據(jù)庫對(duì)定位區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間存在11 個(gè)基因，這為該突變基因的克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)。