陳果亮，陽 坤，唐青海，滕 威，張 可，楊 海，王芳宇

（1.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院&海大集團湖南益豚生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司聯(lián)合研究中心，南岳山區(qū)生物資源保護與利湖南省重點實驗室，湖南衡陽421008；2.海大集團湖南益豚生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司，湖南岳陽414400）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）為單股正鏈RNA 病毒，引起以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病[1]。2010 年以來，由于PEDV 的基因發(fā)生了變異，導(dǎo)致該病再一次爆發(fā)，迅速蔓延至中國、日本、加拿大和美國等養(yǎng)豬國家，死亡率在80%以上，對7 日齡以內(nèi)的仔豬危害尤為嚴重[2-4]。PEDV 編碼的ORF3 基因為非結(jié)構(gòu)基因，調(diào)控豬流行性腹瀉病毒粒子的產(chǎn)量，與PEDV 的致病力密切相關(guān)[5]。S 基因編碼的蛋白在病毒粒子識別靶細胞、與宿主細胞膜融合并且誘導(dǎo)宿主機體產(chǎn)生中和抗體等方面發(fā)揮重要的作用[6]。M 蛋白是由M 基因編碼的PEDV 的主要跨膜糖蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，常被作為診斷PEDV 的重要靶基因[7]。N 蛋白是病毒粒子核衣殼的主要成分，在病毒復(fù)制和細胞感染過程中扮演著非常重要的角色[8]，且PEDV 基因遺傳變異性高，加上近年來變異毒株弱毒疫苗的使用，對PEDV 的進行持續(xù)的分子流行病學(xué)監(jiān)測十分必要。

本研究運用分子生物學(xué)技術(shù)對豬流行性腹瀉病毒HuN-HY1902 毒株進行基因序列分析，為PEDV 的臨床防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與菌株

2019 年2 月，湖南某規(guī)模豬發(fā)生哺乳仔豬大面積腹瀉，病料樣品標記為HuN-HY1902，按照1∶5（w/v）加入0.9%滅菌NaCl 溶液，搖勻，12000 g，4 ℃離心5 min，取上清液采用0.22 μm 濾膜過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆?。DH5a 大腸桿菌感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要試劑

HindIII、BamHI、DAN Maker、pMD-19T、EX Taq 酶和PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均來自TaKaRa 公司；KOD FX Neo 高保真酶為東洋紡(上海)生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和PCR 清潔試劑盒均購自Axygen 公司。

1.3 細胞與病毒的培養(yǎng)

在培養(yǎng)瓶中將單層vero 細胞消化，接種新培養(yǎng)瓶，加入含5%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，待細胞長成60%左右的匯合度時，去掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌3次，更換為無血清的MEM 培養(yǎng)基，按1∶10 的體積比將病料接種細胞中，加入終濃度為3μg/mL 的胰蛋白酶，輕輕混勻，輕輕搖勻，于37 ℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)120 h，收集病毒液，于-80 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3 次，用于下一代次接種。

1.4 病毒的血清學(xué)鑒定

免疫過氧化物酶單層細胞染色法（IPMA）方法參考文獻[9]改進后進行，待細胞長成60%左右的匯合度時，去掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，更換為無血清的MEM 培養(yǎng)基，將1.3 中培養(yǎng)的F3 代病毒按1∶10的體積比將病料接種細胞中，加入終濃度為3 μg/mL 的胰蛋白酶，輕輕混勻，輕輕搖勻，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)12 h，，PBS 洗滌2 次，加入33%的丙酮-PBS，固定15 min，棄掉固定液，干燥30 min，加入200 μL 1∶100 倍稀釋的PEDV N 蛋白多克隆抗體（制備方法見文獻[10]），37℃1 h。PBS 洗滌3 次。加入200 μL 1∶3 000 倍稀釋的酶標二抗HRP-SPA，37 ℃1 h，PBS 洗滌3 次，加入100 μL AEC 底物顯色液，37 ℃15 min。棄掉反應(yīng)液，ddH2O 洗1 次，顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5 RNA 的提取與PEDV 第一鏈cDNA 的合成

取病毒樣本200μL，用Trizol 試劑提取病毒總RNA，在PCR 管中加入RNA 8 μL、Random 6 primers(50 μM)1μL、dNTP Mixture(10 mM each)1μL，輕輕混勻，瞬時離心，65℃保溫5 min 后，冰上迅速冷卻5min。加入5×PrimeScriptIIBuffer 4μL、RNaseInhibitor(40U/μL) 0.5μL、PrimeScript IIRTase(200U/μL)1μL、RNasefreedH2O4.5μL，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃10 min，45℃45 min，70℃15 min，4℃保存，第一鏈cDNA 產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中PEDV 基因組序列（GenBank登錄號：JQ282909），用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計PEDVORF3、sM、N 基因的PCR 擴增特異性引物，引物由深圳華大基因合成，引物信息見表1。

表1 引物序列及其反應(yīng)條件

1.7 PEDV HuN-HY1902 毒株ORF3、sM 和N 基因的PCR 擴增

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL 作為PCR 模板，采用引物PEDV-ORF3U1 和PEDV-ORF3L1 擴 增ORF3 基因、PEDV-sMS 和PEDV-sMR 擴增sM 基因，PEDV-N-F 和PEDV-N-R 擴增N 基因。PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板2μL、KOD FX Neo 1μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25μL、2 mM dNTPs 10μL、上下游引物各1μL、滅菌去離子水10μL，輕輕混勻，瞬時離心，在PCR 儀中進行反應(yīng)：95℃10 min；98 ℃10 sec，62℃30 sec，68 ℃2.5min，35 個循環(huán)；68 ℃7 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、拍照記錄結(jié)果。PCR 產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化、送深圳華大基因科技有限公司進行序列測定。

1.8 基因序列分析

在GenBank 中收集PEDV 基因序列信息，采用DNAStar7.0 軟件對測定的HY1902 毒株基因序列進行對比分析，先用MEGA5.0 軟件包中的ClastlW進行比對，采用最大值法（Maximum Likelhood）繪制該流行株基因的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PEDV HuN-HY1902 毒株的免疫過氧化物酶染色鑒定

采用免疫過氧化物酶染色法檢測分離培養(yǎng)病毒株HuN1902，結(jié)果顯示，兔抗PEDV N 蛋白陽性血清（1∶200 稀釋）與病毒感染細胞染色后細胞質(zhì)呈棕紅色，細胞核無著色，未接種病毒細胞無著色（圖1），表明分離獲得的HuN1902 毒株為PEDV 毒株。

2.2 PEDV HuN-HY1902 毒株的ORF3、sM 和N基因的PCR 擴增

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果在約744 bp、1100 bp 和1400 bp 處得到了特異性的擴增條帶（圖2），與預(yù)期片段長度相符。PCR產(chǎn)物

2.3 PEDV HuN-HY1902 毒株的ORF3、sM 和N基因序列分析

2.3.1 HuN-HY1902-ORF3 基因核苷酸序列與參考毒株同源性與遺傳進化分析

表2 數(shù)據(jù)表明，所擴增到的毒株ORF3 基因與美國毒株Missouri130 相似性最高（99.7%），與中國幾年來的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性為99.6%；與疫苗毒株CV777 相似性96%。

應(yīng)用MEGA5.0 軟件將該毒株的ORF3 基因與國內(nèi)外已發(fā)表的毒株構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果表明，PEDV HuN-HY1902 毒株與Missouri130-2015 毒株以及2018 年中國分離毒株CH-SCMY-2018 處于同一分支，均屬于基因Ⅰ群，與處于Ⅱ群的經(jīng)典疫苗株CV777、SM98 親緣關(guān)系較遠（圖3），兩個不同的基因群毒株在進化上明顯處于不同分支。

表2 HuN-HY1902 ORF3、sM 和N 基因與參考毒株相應(yīng)基因核苷酸序列相似性比較分析

2.3.2 HuN-HY1902-sM 基因核苷酸序列與參考毒株同源性與遺傳進化分析

數(shù)據(jù)表明，所擴增到的毒株sM 基因與國內(nèi)CH-SCMY-2018、BJ-2011-1 毒株和斯洛文尼亞SLO-JH-11-2015 毒株相似性最高（96.3%），KF452323--USA-Indiana-17846-2013 相似性為96.1% ；PEDV/USA/Missouri130/2015 相似性為96.1%；與疫苗毒株CV777 相似性93.9%。

應(yīng)用MEGA5.0 軟件將該毒株的sM 基因與國內(nèi)外已發(fā)表的毒株構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果表明，PEDV HuN-HY1902 毒株與CH-SCMY-2018 處于同一分支，均屬于基因Ⅰ群，但與經(jīng)典疫苗CV777、SM98 和DR13 親緣關(guān)系較遠（圖4）。

2.3.3 HuN-HY1902-N 基因核苷酸序列與參考毒株同源性與遺傳進化分析

數(shù)據(jù)表明，所擴增到的毒株N 基因與中國幾年來的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性最高（98.6%）；與美國流行毒株KJ399978-OH851 相似性98.5%，KF452323-USA-Indiana-17846-2013 相似性為98.5%；PEDV/USA/Missouri130/2015 相似性為98.1%；與疫苗毒株CV777 相似性95.1%。

進化分析表明，PEDV HuN-HY1902 毒株與2018 年的流行毒株如 CH-SCMY-2018、PEDV-MEX-QRO、處于同一分支，均屬于基因Ⅰ群。與經(jīng)典疫苗株CV777、SM98、DR13 不在同一分支，親緣關(guān)系較遠（圖5）。

3 討論

豬流行性病于1971 年首次在歐洲被發(fā)現(xiàn)，我國自2010 年以來，PEDV 感染出現(xiàn)大面積爆發(fā)。近幾年，我國PEDV 變異株變異頻率較高、持續(xù)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較為嚴重的經(jīng)濟損失[11,12]。目前，研究表明，最有效的防治手段為接種疫苗，但是由于其變異較快，防治難度逐漸增大[13]。

本研究通過vero 細胞分離培養(yǎng)、血清學(xué)鑒定，成功分離得到了一株P(guān)EDV 病毒。采用RT-PCR 擴增了PEDV HuN-HY1902 毒株N、sM 和ORF3 基因。運用MEGA 軟件將本毒株與GenBank 中相關(guān)的毒株進行比對分析并制作進化樹。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，本毒株ORF3 基因核苷酸序列與美國流行毒株P(guān)EDV/USA/Missouri130/2015 相似性最高，為99.7%；N 基因核苷酸序列與中國幾年來的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性最高，為98.6%；sM 基因核苷酸序列與中國幾年來的新流行毒株CH/SCMY/2018、BJ-2011-1 相 似 性 最 高，均 為96.3%；相對而言，ORF3、N、sM 基因核苷酸序列與疫苗毒株CV777 相似性均較低，分別為96%、95.1%、93.9%，說明該毒株和疫苗毒株親緣關(guān)系較遠。進化分析顯示，該毒株的ORF3、sM 和N 基因的核苷酸序列與2018 年四川綿陽流行毒株CH/SCMY/2018 處于同一分支，同屬于I 型，而與經(jīng)典毒株CV777、SM98 的親緣關(guān)系較遠。這些數(shù)據(jù)表明，HuN-HY1902 毒株屬于近幾年新流行的變異毒株。這些數(shù)據(jù)提示：（1）PEDV 的變異在持續(xù)，需要加強對該病毒的分子流行病學(xué)監(jiān)測，及時掌握其變異特征，以次指導(dǎo)PEDV 疫苗的改進和新疫苗的開發(fā)；（2）豬場要加強生物安全，特別關(guān)注生豬調(diào)運、引種等帶來的PEDV“引進”風(fēng)險，加強病原的檢測；（3）豬場在商品化的疫苗選用方面，應(yīng)盡可能的選擇與本場流行毒株基因型相匹配的疫苗毒株。本試驗分離并鑒定了一株P(guān)EDV 新流行毒株，命名為PEDV HuN-HY1902 毒株，為PEDV 的疫苗免疫和科學(xué)防控提供了科學(xué)依據(jù)。