劉俊琦

（永州職業(yè)技術(shù)學院，湖南永州425000）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）屬于巴斯德菌科（Pasteurellaceae）家族成員，為豬上呼吸道初期重要寄生菌[1]。HPS 能引起豬的Glasser’s病，主要通過應激反應或激發(fā)感染引起1～4 月齡豬仔豬發(fā)病[2]，患病豬出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、纖維素性漿膜炎、腦膜炎[3]。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的迅速擴大和養(yǎng)豬模式的改變，近幾年本病流行趨勢日趨嚴重，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。目前動物疫病檢測實驗室對本病的診斷主要為流行病學調(diào)查、臨床癥狀分析、病理變化檢測，細菌學診斷[5]。然而，副豬嗜血桿菌常與其他細菌或病毒混合感染，給獸醫(yī)臨床診斷帶來了困難，易造成了誤診、漏診。已有文獻表明大量健康豬只正常攜帶HPS[1]，但獸醫(yī)實踐中HPS 分離率較低，推測主要是由于HPS 的分離培養(yǎng)易受抗生素或化學治療劑等因素的影響，且細菌營養(yǎng)條件要求較高，保存時間較短[6-7]。因此，傳統(tǒng)的診斷技術(shù)已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代豬病發(fā)展的需求，因此，快速、準確地診斷該病以便采取相應的措施，是成功預防和控制本病的關(guān)鍵。當前市場上用于檢測HPS 的商品化ELISA 試劑盒主要以HPS 全菌為包被抗原。由于全菌具有潛在的散毒風險，并且HPS血清型較多又缺乏有效的交叉保護[8-10]，因此研究應用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)及免疫學技術(shù)構(gòu)建安全、高效的基因工程蛋白ELISA 檢測方法乃大勢所趨。

神經(jīng)氨酸酶蛋白（Neuraminidase，Neu）是HPS重要的一個毒力蛋白，該蛋白廣泛存在于各血清型PHS[11]。Neu 參與細菌外膜部分[12]，這種脂低聚糖具有唾液酸化作用。Neu 可將唾液酸殘基裂解成神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1，在轉(zhuǎn)變?yōu)閍silo-GM1，而該物質(zhì)是4型菌毛的優(yōu)先結(jié)合物[13]。在其他一些細菌中已證實Neu 參與生物被摸形成并發(fā)揮著重要作用[14]。此外，有報道稱正是由于Neu 的作用功能，細菌能有效地定植于宿主體內(nèi)，因此Neu 是發(fā)展動物疫苗的候選基因之一[15-16]。

1 材料與方法

1.1 血清及抗原

PHS 陽性血清和陰性血清來自于美國Synbiocits 公司的ELISA 試劑盒。豬鏈球菌陽性血清、豬胸膜肺炎防線桿菌陽性血清、豬瘟病毒陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬圓環(huán)病毒2 型陽性血清均來自于武漢科前生物股份有限公司的ELISA 檢測試劑盒；臨床待檢血清采集于湖南省永州市冷水灘區(qū)、東安縣、藍山縣、寧遠縣等地多家豬場，共計血清樣品164 份。參照文獻[17]由上海生工生物工程（上海）股份有限公司克隆、表達并純化Neu 蛋白。

1.2 主要試劑

牛血清蛋白（BSA）購自于天津康源生物技術(shù)有限公司；胰酶大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購自于上海艾研生物科技有限公司；兔抗豬酶標二抗購自于北京博爾西科技有限公司；96 孔酶標板購自于百千生物公司。

1.3 Neu 重組蛋白最佳包被濃度、血清最佳稀釋度的確定

將純化的New 蛋白稀釋濃度為400 ng/100 μL、200 ng/100 μL、100 ng/100 μL、50 ng/100 μL、25 ng/100 μL，取100μL 稀釋的Neu 蛋白加入96 孔酶標板。將PHS 血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 比例稀釋，取100μL 稀釋的血清加入96 孔酶標板。參照間接ELISA 操作步驟檢測各濃度樣本的OD450nm值。將陽性血清的OD450nm值設(shè)置為P, 陰性血清的OD450nm設(shè)置為N，并以當P/N 值最大時對應的濃度設(shè)置為最佳作用濃度。

1.4 抗原抗體反應時間、酶標二抗反應時間、底物顯色時間的確定

將抗原、抗體反應時間設(shè)置為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，各個時間點設(shè)置2個重復。將酶標二抗反應時間設(shè)置為15 min、30min、45 min、60 min、75 min、90 min，各個時間點設(shè)置2 個重復。將底物顯色時間設(shè)置為10 min、15 min、20 min、25 min、30min，各個時間點設(shè)置2 個重復。各反應均以P/N 值最大時對應的時間為最作用時間。

1.5 特異性試驗

應用本研究建立的Neu-ELISA 方法對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎防線桿菌、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型陽性血清進行抗體檢測，測定其OD450nm值。

1.6 臨床待檢樣品的檢測

應用反應條件優(yōu)化后構(gòu)建的Neu-ELISA 方法檢測64 份臨床待檢血清，測定待檢血清樣本OD450nm值。根據(jù)檢測結(jié)果初步測定PHS 在永州地區(qū)的流行情況。

2 結(jié)果

2.1 Neu-ELISA 最佳反應條件的確定

對構(gòu)建的Neu-ELISA 反應條件進行篩選，結(jié)果表明抗原最佳包被濃度為100 ng/100 μL，血清最佳稀釋度為1∶160，抗原、抗體最佳作用時間為60 min，酶標二抗最佳作用時間為60 min，底物顯色最佳作用時間為20 min。

2.2 Neu-ELISA 基本操作程序

根據(jù)篩選的最佳實驗條件，構(gòu)建Neu-ELISA基本操作程序：用包被液將Neu 蛋白稀釋為100 ng/100 μL，取100μL 稀釋的Neu 包被96 孔酶標板，先37℃孵育2h，隨后4℃過夜吸附；PBST 洗滌液洗滌3～5 次（5 min/ 次）并拍干；每孔加入100 μL 含有0.15%的BSA 封閉液，37 ℃孵育1h，PBST洗滌液洗板3～5 次并拍干；每孔加入100μL 應用PBS 稀釋的血清，37℃孵育1h，PBST 洗滌液洗板3～5 次并拍干；每孔加入100μL 稀釋的兔抗豬酶標二抗，37℃孵育1h，PBST 洗滌液洗板3～5 次并拍干；加入現(xiàn)配的OPD-H2O2底物顯色液，37 ℃避光顯色20min；每孔加入50μL 濃度為2mol/L 的H2SO4終止液，測定樣品的OD450nm值（圖1）。

2.3 Neu-ELISA 特異性試驗結(jié)果

應用Neu-ELISA 方法分別檢測豬鏈球菌、豬胸膜肺炎防線桿菌、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、副豬嗜血桿菌陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示HPS 血清為陽性，其余血清的OD450nm值均小于HPS 為陰性，表明本研究所構(gòu)建的Neu-ELISA 方法具有較好的特異性（表1）。

表1 Neu-ELISA 特異性試驗結(jié)果Table 1 The specificity test of Neu-ELISA

2.4 送檢臨床血清樣品檢測結(jié)果

表2 待檢血清Neu-ELISA 抗體的檢測結(jié)果Table 2 Neu-ELISA results of serum samples

應用本研究所構(gòu)建的Neu-ELISA 方法對湖南省永州市多地區(qū)豬場的164 份待檢血清進行檢測。Neu-ELISA 檢測結(jié)果顯示，豬場待檢血清樣品中陽性檢出率為19.51%，其中母豬陽性檢出率為9.1%，哺乳仔豬陽性檢出率為18.33%，育肥豬陽性檢出率為23.17%。

3 討論

目前副豬嗜血桿菌已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，因此建立一種快速、有效的診斷方法迫在眉睫。有研究表明循環(huán)抗體的出現(xiàn)與針對HPS系統(tǒng)性感染的保護具有關(guān)聯(lián)性[18]。通過初乳獲得被動免疫是仔豬抵抗臨床HPS 感染的主要機制[19-20]。當前ELISA 檢測方法是檢測速度較快、應用最廣、商品化較成熟的一種廣譜性檢測方法[5]。據(jù)報道副豬嗜血桿菌具有較多的血清型[8-9]，各血清之間又缺乏有效的交叉保護[10]，且全國各地流行菌株存在較大差異。當前我國市場上所使用的商品化ELISA檢測試劑盒主要是以HPS 全菌作為包被抗原，該方法對相同血清型HPS 檢測具有很強特異性，但對不同血清型HPS 的準確度明顯減低，甚至出現(xiàn)大量假陰性和假陽性。在2011 年前，僅有少量的血清特異性檢測方法用于監(jiān)測HPS 血清樣本，但是沒有檢測方法能測定所有血清型；2011 年Macedo N等人構(gòu)建了以物種特異性寡核苷酸滲透酶A（OppA）多肽為包被抗原的ELISA 商品化檢測試劑盒[21]。OppA 多肽是一個跨膜蛋白且是ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組成部分[22]，是免疫顯現(xiàn)蛋白，由此構(gòu)建的OppA-ELISA 具有廣譜檢測性，研究者認為該方法可用于追蹤全身性感染，而不用考慮HPS 血清型[21]。重組Neu 蛋白具有較強的免疫原性[15]，是副豬嗜血桿菌的一個重要毒力因子，并且Neu 蛋白是所有血清型菌株都含有的重要蛋白，且Neu 在個血清型HPS 中存在著一定的交叉保護[23]，因此可對各血清型菌株進行檢測，準確度會有明顯提高。本研究通過對Neu-ELISA 實驗條件進行優(yōu)化，建立了一種快速、高效的ELISA 診斷方法。試驗表明本研究構(gòu)建的Neu-ELISA 方法對診斷副豬嗜血桿菌病具有非常強的特異性。同時筆者應用該研究構(gòu)建的ELISA 檢測方法對164 份采集于永州多地豬場的血清進行檢測，結(jié)果表明永州地區(qū)副豬嗜血桿菌病總感染率為19.51%，其中育肥豬感染率最高，母豬感染率相對較低，本研究為永州地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行病學調(diào)查奠定了研究基礎(chǔ)。