沈 玲,白 歡,李 麗,汪 玥,龔 路,孫自鏞,陳中舉

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，武漢 430030）

近些年來，微生物檢驗新技術(shù)不斷出現(xiàn)，包括GeneXpert/FilmArray、基因芯片檢測、高通量測序技術(shù)（NGS）、MALDI-TOF MS 等。MALDI-TOF MS，即基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜，通過檢測待檢病原菌株蛋白以獲取其質(zhì)譜峰結(jié)果，同時對比龐大的菌株數(shù)據(jù)庫內(nèi)標準菌株的蛋白質(zhì)譜峰圖譜，從而實現(xiàn)對待測菌株的鑒定[1]。與傳統(tǒng)微生物鑒定方法相比，MALDI-TOF MS 具有操作簡單、快速、靈敏度高、準確度好、高分辨率等優(yōu)勢，從而逐漸進入臨床微生物實驗室[2]，基于此，目前市面出現(xiàn)了諸多品牌的MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析系統(tǒng)，鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的型號為Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)便為其一，然而其儀器性能如何，是否可在臨床實驗室廣泛推廣，在國內(nèi)尚無報道。本研究旨在評價Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在臨床常見病原菌中的鑒定能力，從而為其能否在臨床微生物實驗室廣泛應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

1.1.1 準確度評估：選取華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院2018年6月～2019年6月231 株能夠涵蓋實驗室80%～90%的常見分離菌株和1 株室間質(zhì)控菌株（國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心1705 二路普雷沃菌，厭氧菌屬）作為檢測標本，其中革蘭氏陽性需氧菌77 株，革蘭氏陰性需氧菌95 株，厭氧菌30 株，酵母樣真菌30 株。

1.1.2 精密度評估：選取ATCC25922 大腸埃希菌等12 株室內(nèi)質(zhì)控菌株和臨床分離菌株作為檢測標本，其中革蘭氏陽性需氧菌4 株，革蘭氏陰性需氧菌6 株，酵母樣真菌2 株。

1.2 主要儀器及試劑 德國布魯克公司質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)IVD MALDI BIOTYPER 及其配套試劑；鄭州安圖生物工程股份有限公司Autof MS1000 全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)及其配套試劑;美國伯樂公司核糖體16S RNA 測序儀及其配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定方法：

1.3.1.1 Bruker MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定：取凍存菌株傳代兩代至哥倫比亞血平板或臨床分離菌株細菌均勻點種在靶板各個孔位內(nèi)，使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照儀器操作手冊操作。

1.3.1.2 Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定：取凍存菌株傳代兩代至哥倫比亞血平板或臨床分離菌株細菌均勻點種在靶板各個孔位內(nèi)，使用直接涂布法或是甲酸涂布法按照儀器操作手冊操作。

1.3.1.3 核糖體16s RNA 測序：取臨床菌量1ml，采用煮沸法進行DNA 提取; 以引物PSL，UNI 進行寬范圍PCR 擴增16s rRNA（真菌需要把its 區(qū)域保守序列擴增）;PCR 產(chǎn)物純化;上機測序，測序儀器：ABI 公司的3500Dx。

1.3.2 儀器評估方法

1.3.2.1 準確度評估：標準菌株和質(zhì)評菌株為已檢測菌株，臨床分離菌株已經(jīng)實驗室現(xiàn)有鑒定設備Bruker MALDI-TOF 進行檢測。對上述已檢測菌株在Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進行鑒定，評價Autof MS1000 鑒定結(jié)果與Bruker MALDI-TOF鑒定結(jié)果的符合性。鑒定可以是屬的水平或種的水平，但對于關(guān)鍵微生物（如，肺炎鏈球菌），鑒定到種是至關(guān)重要的。有差異鑒定結(jié)果的分離株應使用當前的Bruker MALDI-TOF 和待評價系統(tǒng)（Autof MS1000）進行重新檢測，若依然存在差異則采用第三種方法（核糖體16s RNA 測序）進行確認。

1.3.2.2 精密度評估：選取ATCC25922 大腸埃希菌等12 株菌在Autof MS1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)上進行重復性測試，每株菌重復檢測3 次。

1.3.3 結(jié)果判讀：依據(jù)CLSI M52 對商業(yè)化微生物鑒定系統(tǒng)（MIS)驗證的建議，準確度超出90%，精密度超過95%即被認定為通過[3]。

2 結(jié)果

2.1 準確度評估 共納入232 株菌株，其中77 株革蘭氏陽性需氧菌，其中包括葡萄球菌屬20 株，腸球菌屬18 株，鏈球菌屬37 株，其他2 株（棒桿菌屬1 株，李斯特氏菌屬1 株）；95 株革蘭氏陰性需氧菌，其中包括腸桿菌屬46 株，假單胞菌屬7 株，不動桿菌屬16 株，莫拉菌屬5 株，嗜血桿菌屬2 株，氣單胞菌屬4 株，伯克霍爾德菌屬3 株，木糖氧化無色小桿菌3 株，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌4 株，其他5株（速生短桿菌1 株，中間蒼白桿菌1 株，腦膜膿毒伊金氏菌1 株，分散泛菌2 株）；30 株厭氧菌，其中包括梭菌屬9 株，擬桿菌屬12 株，普雷沃菌屬2 株，大芬戈爾德菌2 株，遲緩艾格特菌2 株，其它3 株（小韋榮氏球菌1 株，齲齒放線菌1 株，海氏嗜胨菌1 株）；30 株酵母菌。其鑒定符合率為100%，即準確度為100%。因鑒定結(jié)果均一致，故未使用到測序方法做確證試驗。

2.2 精密度評估 選取ATCC25922 ECO*，ATCC49247 HIN,A190609196 PAE，ATCC25923 SAU，ATCC22019 CPA，B190608252 SAU，ATCC27853 PAE，A190609045 ECO*，A190607291 SPN**，ATCC49619 SPN**，A190608193 ABA 和F190610024 CAL（*為大腸埃希菌/志賀菌不能區(qū)分的結(jié)果加做吲哚試驗進一步確認為大腸埃希菌，**為肺炎鏈球菌需經(jīng)奧普托欣試驗作進一步確認)等12 株室內(nèi)質(zhì)控菌株和臨床分離菌株進行重復性測試，每株菌檢測的重復性結(jié)果均為100%，即精密度為100%。

3 討論

MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析技術(shù)近年來發(fā)展迅速，在臨床微生物鑒定領(lǐng)域，憑借其高通量、試劑成本低、操作簡單、使用菌量少，且可鑒定出某些傳統(tǒng)鑒定方法鑒定菌株種屬困難的優(yōu)勢，而迅速走紅臨床微生物實驗室，大有取代傳統(tǒng)微生物鑒定方法之趨勢[2]。

鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的型號為Autof MS1000 的全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)基于MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析技術(shù)，主要用于細菌、酵母樣菌、絲狀真菌、分枝桿菌等菌株的檢測，具有MALDI-TOF MS 技術(shù)快速、準確、高通量等特點，同時擁有超過2 000 菌種數(shù)據(jù)的中國本土化數(shù)據(jù)庫，然而其儀器實際性能如何，是否可在臨床微生物實驗室廣泛使用，國內(nèi)尚無相關(guān)報道。鑒于此，對Autof MS1000 全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)作出適宜的儀器性能評估顯得尤為重要。本研究主要從儀器性能的準確度和精密度兩個最重要的方面來對Autof MS1000 全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)在臨床微生物實驗室中常見病原菌鑒定能力的評估。BESSèDE 等[4]使用MALDI TOF MS 鑒定了1 013 株細菌，其中986 株菌被準確鑒定到種水平，其種水平鑒定準確度為97.3%；SENG等[5]運用MALDI-TOF MS 鑒定了1 660 株菌，其中84.1%準確鑒定到種水平，另11.3%準確鑒定到屬水平，總體鑒定準確度為95.4%。在本研究中，Autof MS1000 總體鑒定準確度達100%，精密度達100%，性能指標明顯優(yōu)于國外相關(guān)的研究數(shù)據(jù)，評估結(jié)果符合CLSI M52 對商業(yè)化微生物鑒定系統(tǒng)（MIS)驗證建議的要求[3]，亦滿足臨床微生物實驗室對微生物鑒定的需求，建議可在臨床微生物實驗室推廣使用。但由于本研究中納入評估的菌株數(shù)量有限，且基本為實驗室常見菌株，后續(xù)需進一步納入大樣本、罕見菌以對儀器作出更加全面可靠的性能評估。另外值得特別注意的是，由于MALDI- TOF MS 技術(shù)本身的局限性，對于一些近緣種及亞種不能進行有效的區(qū)分[6]，如在本研究中，大腸埃希菌/志賀菌不能區(qū)分的結(jié)果需加做吲哚試驗進一

步確認為大腸埃希菌，肺炎鏈球菌需經(jīng)奧普托欣試驗作進一步確認，實驗室需充分了解其局限后，在必要時采用適當?shù)难a充實驗以作進一步的區(qū)分。除病原微生物菌種鑒定領(lǐng)域外，隨著MALDI -TOF MS 技術(shù)的不斷發(fā)展，其在細菌耐藥性方面亦取得諸多新的成果[7]，質(zhì)譜分析技術(shù)在臨床微生物實驗室的應用前景值得期待。