劉春玲，鄭海興，孫 艷，董建將，欒麗娟，王純波，穆寅東，祖國(guó)美，楊國(guó)宏*

（牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

作為老年群體的常見病，AD以預(yù)后差、病程長(zhǎng)為基本特征[1]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，這一狀況限制了其治療體系的擴(kuò)展。研究指出，外泌體與AD的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[2]。因此，分析AD患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及研究對(duì)象

儀器：微量移液器；低溫高速離心機(jī)；酶標(biāo)儀；電泳槽等。試劑：BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒；兔抗CD63；ECL底物液；Exo Quick Exosome Precipitation Solution（以下記為Exo Quick試劑盒）等。

選擇我院于2018年10月～2019年7月收治的30例AD患者為研究對(duì)象。男19例，女11例；年齡（64.7±11.6）歲。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本采集方法

于清晨采集30例AD患者的空腹靜脈血5 ml，置于血清分離膠試管內(nèi)。于室溫條件下持續(xù)靜置0.5 h后，置于4℃溫度下，按照3000 r/min轉(zhuǎn)速，持續(xù)離心5 min，取上層血清標(biāo)本保存待檢。

1.2.2 外泌體提取鑒定方法

提取方法：將血清標(biāo)本置入干凈試管內(nèi)，向其中混入適量Exo Quick，充分混勻后，于4℃條件持續(xù)孵育0.5 h；所得混合物按照1500 r/min轉(zhuǎn)速持續(xù)離心0.5 h；清除上清液后，再次按照上述轉(zhuǎn)速離心處理5 min，即可獲得外泌體（沉淀）。向沉淀內(nèi)混入100～500 μl 1x PBS重懸液，獲取外泌體溶液。

鑒定方法：于4℃條件下，以0.1 M磷酸緩沖液及2.5%濃度戊二醛固定2 h外泌體（形態(tài)：組織塊）；采用大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)固定后的外泌體組織塊，持續(xù)漂洗3次；于室溫下，經(jīng)0.1 M磷酸緩沖液、1%鋨酸持續(xù)固定2 h；取大量0.1 M磷酸緩沖液漂洗經(jīng)第二次固定處理的外泌體，漂洗次數(shù)與第一次漂洗一致；將外泌體組織塊分別置于濃度為50%、70%、80%、90%、95%及100%的酒精上進(jìn)行脫水處理；以812包埋劑、純812包埋劑進(jìn)行滲透處理；于60℃條件下，持續(xù)聚合48 h；按照60～80 nm標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)外泌體組織塊進(jìn)行切片；以鈾鉛雙染色法進(jìn)行染色處理，最后將其置于電鏡下進(jìn)行鑒定。

1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

經(jīng)封閉處理后，以封閉液稀釋一抗，于一抗孵育液內(nèi)浸入PVDF膜，置于4℃條件下持續(xù)孵育（過夜）；采用TBST洗去多余一抗；以封閉液稀釋二抗（HRP標(biāo)記），確認(rèn)PVDF膜充分浸潤(rùn)于二抗孵育液內(nèi)后，于37℃條件下孵育2 h；以TBST洗去多余二抗；按照1：1比例，混合過氧化物酶及增強(qiáng)液，于PVDF膜表面滴加適量工作液，待充分反應(yīng)后，以X光膠片進(jìn)行壓片處理，分別以顯影液、定影液顯影、定影，最終獲得膠片。將掃描出的膠片采用BandScan進(jìn)行分析（灰度值參數(shù)）。以電泳儀完成蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

本研究中AD患者的外泌體鑒定結(jié)果為：平均直徑（92.64±23.41）nm；30份標(biāo)本的CD63抗體檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果提示：外泌體組塊中，免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原表達(dá)異常。

3 討 論

近年來，AD發(fā)病率逐漸升高[3]。明確AD的發(fā)病機(jī)制、早期診斷AD，已經(jīng)成為改善AD患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。

外泌體作為一種常見小膜泡，其可由多類細(xì)胞分泌。這種膜泡天然存在于乳汁、尿液等體液中。這種膜泡被證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞的侵襲機(jī)制、免疫應(yīng)答及細(xì)胞遷移等多種機(jī)制中[4]。近年來，隨著臨床關(guān)于這種膜泡研究的不斷深入，其與AD之間的關(guān)聯(lián)逐漸引起了人們的重視。外泌體可參與海馬神經(jīng)元突觸、神經(jīng)發(fā)育及再生機(jī)制。當(dāng)機(jī)體星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元分泌外泌體后，處于游離狀態(tài)的外泌體可與受體細(xì)胞發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)體包膜發(fā)生融合反應(yīng)，對(duì)疾病相關(guān)蛋白形成一定的調(diào)控作用?；谏鲜鲎饔?，可初步判斷：外泌體與AD的形成及發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。

對(duì)于患者血清中的外泌體，可用的檢測(cè)方法較多，如色譜法及超速離心法等。上述方法雖然可證實(shí)血清標(biāo)本中外泌體的存在，但所提取的外泌體標(biāo)本，難以保持良好的生物活性及純度水平。相比之下，Exo Quick試劑盒所采用的免疫沉淀法，則可借助沉淀反應(yīng)，將存在于患者血清中的外泌體以沉淀形式提取出來，且這種方法可保障提取物具有生物活性。本研究以Exo Quick試劑盒提取并經(jīng)電鏡鑒定，30例AD患者的外泌體直徑參數(shù)與既往研究一致。這一結(jié)果表明：這種提取方法，可為AD患者的診斷及病情評(píng)估提供一定支持。

而從AD患者外泌體組塊的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果來看，其在多種蛋白質(zhì)方面存在異常表達(dá)現(xiàn)象。根據(jù)上述結(jié)果，可考慮將免疫球蛋白重鏈、維生素D結(jié)合蛋白及CD5抗原這三種蛋白納入AD的初篩診斷、預(yù)后評(píng)估中，通過對(duì)患者上述三種蛋白表達(dá)狀況的監(jiān)測(cè)，判斷其合并AD的風(fēng)險(xiǎn)，并以此為依據(jù)，調(diào)整AD患者的治療方案。

綜上所述，Exo Quick試劑盒可為AD血清外泌體的提取鑒定提供支持，而蛋白質(zhì)組學(xué)分析則有助于更新AD的診斷方法。