黃聲震，呂長勝

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院，北京，100144）

我國每年出現不同類型皮膚缺損的患者高達數千萬[1]，包括嚴重燒傷、軟組織壞死、腫瘤切除術等引起的廣泛全層皮膚缺損，而臨床上自體皮膚移植供區(qū)有限，所以替代人工皮膚的需求很大。

皮膚是人體面積最大的器官，占總體重的16%并且具有1.8微米的平均表面積[2]，正常皮膚分三層：表皮層主要為角質形成細胞，相對較?。?0-100微米），起屏障的功能；真皮層較表皮厚（400-2000 微米），其中成纖維細胞通過分泌細胞外基質提供皮膚機械強度，血管運輸營養(yǎng)、生物活性物質、免疫細胞、排泄代謝廢物等；皮下組織主要是脂肪，起支持表皮和真皮、隔熱、機械保護的作用[3]。組織工程皮膚三個要素被認為是：支架材料、種子細胞、血管形成。隨著各個學科的發(fā)展，很多開發(fā)新血管化策略的研究取得了快速進展。這些策略可以分為血管生成和預血管化的方法[4]。

1 血管化策略機制

新血管形成包括兩種的機制：血管發(fā)生（Vasculogenesis)、血管新生(Angiogenesis）。內皮前體細胞或成血管細胞分化為內皮細胞來形成原始血管網絡被稱為血管發(fā)生，主要在胚胎發(fā)育時形成血管系統(tǒng)[5]。血管新生是指從原來的血管中生長出新的毛細血管，主要負責血管網絡的重塑和擴展，包括兩種不同的機制：內皮發(fā)芽和腸套疊微血管生長（IMG）[6]。內皮發(fā)芽過程包括內皮細胞遷移、增殖和管狀腔隙形成，IMG 通過組織折疊和組織間組織的插入到血管腔中來劃分現有的血管腔。血管新生可能是由缺氧引起的，缺氧會上調許多基因的表達來參與血管形成，包括NO 合酶、VEGF 和血管生成素-2，血管受到NO的影響而擴張，并且受到VEGF 的作用而滲透性增加，主要是蛋白酶活化作用于基底膜和細胞外基質使其溶解，血漿蛋白質滲漏出來作為臨時基質，然后內皮細胞在整聯(lián)蛋白和基質之間的相互作用下遷移，并在血管內皮生長因子（VEGF）和其他分裂素作用下增殖，然后血管芽吻合形成血管環(huán)和網絡[7]。在傷口愈合過程中，VEGF 出現強烈表達，其特征是微血管通透性和血管生成增加，機制是由角蛋白14 啟動子驅動的皮膚中VEGF 的轉基因過表達導致曲折的皮膚毛細血管密度增加[8]，所以VEGF 在血管生成過程的起重要作用，不僅啟動血管形成，還啟動一系列分子和細胞事件，最終生成成熟的血管網絡。

血管新生在許多病理狀態(tài)中被誘導，例如傷口愈合、慢性炎癥，組織工程皮膚中血管化通常被認為是通過正常血管新生過程實現的，主要通過內皮發(fā)芽實現。而血管生成機制的研究進一步深入，能更好的引導組織工程皮膚血管化的策略方向。

2 支架層面的血管化策略

真皮支架模仿天然皮膚真皮層，其中含有致密的微血管網，滋養(yǎng)表皮角質形成細胞，同時它的細胞外基質（包括膠原纖維、彈性纖維等）維持生長，研究發(fā)現人工真皮的存在就可誘導VEGF 的表達，并促進血管內皮細胞的增殖和新血管的形成[9]，說明支架在組織工程血管化中起關鍵作用，同時支架材料及支架結構的孔隙率、孔隙大小、機械強度、生物降解等均能在不同程度影響血管化。

2.1 支架材料

水凝膠是最常見的生物支架材料，是天然親水聚合物形成的三維（3D）網絡，包括多糖（例如透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖和纖維素）、蛋白質（膠原蛋白、明膠）和DNA 等，類似于天然細胞外基質（ECM）。與Integra 支架相比，交聯(lián)水凝膠的血管生成反應顯著增強，水凝膠處理能夠促使完整的皮膚再生[4]。膠原蛋白被證明可以促進生物材料的血管形成，促進人類毛細血管樣網絡的自發(fā)形成[10]。細菌纖維素本身具有傷口愈合和組織再生特性，改良的納米復合材料能夠形成健康的肉芽和豐富血管[11]。Carriel 等[12]使用纖維蛋白-瓊脂糖生物支架開發(fā)全層人皮膚構建體，離體和體內水平評估表明支架在發(fā)育4 周后保持穩(wěn)定，并且體內植入能夠使真皮適當分化，并且植入后第10 天存在大量成纖維細胞和血管。

2.2 支架結構

2.2.1 孔徑和互連性支架結構層面血管化主要由其孔徑和互連性決定。支架的微結構比如孔徑率和纖維排列，可以影響細胞的生長、遷移、增殖等，支架的三維結構允許細胞的黏附增殖、向內生長并為血管生長提供必要的空間，因此影響血管形成過程[13]，通常認為孔徑率需大于70%。Choi,S.W 等[14]實驗證明孔徑＞200μm 的支架有利于形成低密度和深穿透的具有大血管的血管網絡，而孔徑＜200μm 的支架有利于形成較高密度和較低穿透深度的較小血管，可用于構建不同大小的組織。雖然孔徑對血管形成具有較大影響，孔隙互連對于生物材料支架同樣關鍵，不完全的孔隙相互連接可能限制血管長入，Xiao X 等[15]通過激活PI3K/Akt 途徑，研究三維多孔β-磷酸三鈣支架互連大小誘導血管新生的不同作用，證明具有150mm互連尺寸的支架顯著增強了Akt和eNOS磷酸化，刺激NO 產生，不僅增強內皮細胞增殖、改善內皮細胞功能，還通過促進細胞粘附和遷移，增強血小板-內皮細胞粘附分子和血管內皮生長因子的表達。

2.2.2 支架加工技術常用的支架加工技術包括常用的冷凍干燥、鹽浸和傳統(tǒng)靜電紡絲技術，但易形成薄片狀納米纖維，形成小而不規(guī)則的孔結構[16]。靜電紡絲技術是允許微米或納米尺度的連接纖維的技術，電紡支架的松散結合和多孔性質有利于細胞遷移和整個支架中的均勻分布[17]。不同結構的電紡納米纖維通過重塑細胞骨架和細胞核來影響細胞行為，對齊的納米纖維的結構信號通過旁分泌效應和間隙連接激活刺激細胞-細胞通訊[18]。

生物打印是一種經濟可行且可重復的創(chuàng)建空間組織的方法，能夠模仿健康天然的皮膚組織[19]。由于其使細胞和基于細胞的材料可以以精細的空間排列分配以模仿天然組織而成為吸引人的生物加工平臺，通過構建具有預定結構的載有細胞的支架，來實現微環(huán)境的再現[20]。Kim 等[21]將皮膚衍生的細胞外基質首次配制成可印刷材料并保留了皮膚的主要ECM 組合物以及有利的生長因子和細胞因子，用于印刷全厚度3D 人體皮膚模型，并進一步使用這種bioink 印刷3D預血管皮膚片。

2.3 物理/化學修飾支架

支架材料的物理化學性質顯著影響其血管形成，目前生物材料的生物活性已被廣泛關注，最廣泛報道的生物玻璃（BG）（主要是離子產品）的化學信號能夠促進成纖維細胞的基質合成和內皮細胞的分化及血管生成，在傷口愈合的早期階段，由BG 激活的成纖維細胞可以遷移到傷口部位，合成細胞外基質作為新形成血管的床[18]，并刺激成纖維細胞表達一些關鍵細胞因子和重要蛋白質[22]。Xu Y等[18]發(fā)現BG離子產物和定向納米纖維可以協(xié)同上調血管生成生長因子和細胞外基質蛋白的表達，它的化學信號主要通過增強旁分泌效應刺激細胞-細胞通訊，刺激內皮細胞和成纖維細胞中基質蛋白中血管生成生長因子的表達上調，分泌的血管生長因子進一步誘導內皮細胞遷移到傷口部位。不同刺激信號和關鍵細胞共培養(yǎng)物的組合可能是組織工程的有前景和有效的方法。近年認為等離子處理表面活化是能夠改善血管生成的有潛力的技術，Ring,A 等人[10]將低壓氬/氫等離子體處理的膠原蛋白-彈性蛋白基質支架移植到小鼠背部皮膚折疊室中，與未處理的對照相比，這種表面活化增強了血管生成并加速了修飾的膠原-彈性蛋白基質的新生血管形成。Wang X 等[23]制備了聚（L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）針織網與膠原-殼聚糖支架（CCS）整合以獲得混合支架，PLGAm/ CCS 中的膠原蛋白-海綿仍保持多孔，相互連接并占據PLGA 網孔，相較僅由膠原-殼聚糖組成的支架，提高了機械強度。

2.4 光合支架

移植組織工程皮膚后血管形成時間較長，而氧的擴散有限，溶解度低，消耗率高，對于較厚移植皮膚中心細胞可能會出現缺氧。移植皮膚內產生的氧梯度與細胞的增殖直接相關，也影響基因表達和基質沉積等。Hopfner 等人[24]通過名為HULK（來自德國Hyperoxie Unter Licht Konditionierung 的縮寫）的方法將單細胞和光合微藻接種到支架中培養(yǎng)用于組織修復，這種微藻顯示出高生物相容性和光合作用，將支架暴露于光照能夠觸發(fā)光合作用并且實現原位氧產生并且產生足夠的氧氣。

除了氧氣之外，對這種光合支架進行基因工程以提供其他關鍵分子，比如Myra Noem 等[25]將載有表達血管生成重組蛋白VEGF 基因的微藻接種于支架，證實除了氧之外，光合支架能夠釋放重組生長因子，進一步促進組織再生。

2.5 生物激活因子

VEGF 是血管生成過程中的關鍵介質，是內皮細胞的有效促分裂原，并能夠通過上調幾種內皮整合素受體誘導內皮細胞遷移和發(fā)芽，移植單獨的VEGF 會誘導不穩(wěn)定的血管結構（滲漏血管）；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）通過對內皮細胞的直接作用和間接作用上調內皮細胞的VEGF 來促進血管生成，這兩個因子的協(xié)同作用通過募集平滑肌肌動蛋白陽性細胞來穩(wěn)定血管壁，血小板衍生生長因子通過募集周細胞和分化未成熟的內皮細胞來促進血管生成[26]。所以持續(xù)傳遞各種活性因子至真皮支架能夠促進血管化作用,目前已成為一種廣泛的血管化策略。由于蛋白穩(wěn)定性和免疫活性的限制，這些活性因子的可持續(xù)釋放是很重要的，Li W 等[27]用明膠微球的方式作為長期釋放和隨后的血管生成加強的平臺，得到了有意義的結果。

3 基于細胞的血管化策略

在皮膚組織工程中增加血管生成的一個重要方法是將細胞接種到支架上，包括內皮細胞及其祖細胞、成纖維細胞、各類干細胞等，其中內皮細胞是組成血管結構的主要細胞，在血管化方面起著關鍵作用，但是移植細胞需要滿足以下條件：易于獲得及培養(yǎng)擴增，存活率高，無或較低的免疫原性，不會導致癌變等。

3.1 內皮細胞

內皮細胞來源有丟棄的包皮、人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）等，但成熟的內皮細胞在臨床條件下不容易大量收獲并且在培養(yǎng)期間表現出低復制率，在3D培養(yǎng)中迅速凋亡[28]，而當種子HUVEC 經逆轉錄病毒轉導以組成型表達抗凋亡蛋白Bcl-2 時，血管化濃度和成功植入的頻率進一步增加，這種操作增加了HUVEC 形成成熟血管的能力，且Bcl-2 轉導使HUVEC對一些形式的免疫介導的損傷具有抗性[29]。

內皮細胞的前體細胞：內皮祖細胞，存在于骨髓及血液中，可以誘導成血管內皮細胞，參與缺血組織的血管重建和血管的內膜化[30]?？梢詮难褐蟹乔秩胄苑蛛x，具有高克隆性潛力。Dai NT 等[31]將人內皮祖細胞和成纖維細胞的混合物接種到人血漿/氯化鈣形成的凝膠支架中，結果顯示預血管化的凝膠支架在手術后顯著加速傷口愈合，組織學分析顯示傷口區(qū)域的表皮和真皮的血管形成。

一些活性分子能夠刺激增加內皮細胞量，蔡第心[32]使用EPO 動員EPCs，發(fā)現外周血EPCs 含量更多。研究發(fā)現基質細胞衍生因子-1α 能夠與EPC 表面的特異性受體CXCR4(chemokine CXC receptor type4,CXCR4)結合并趨化EPC，在短時間內動員骨髓中EPC 進入外周血，并介導外周血中的EPC 遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，促進血管新生及損傷血管的再內皮化，利用過表達SDF-1α 基因的方法，有學者構建了一種自動捕獲內皮祖細胞的新方法來促進皮膚替代物血管化，為促進組織工程皮膚快速血管化提供了新思路[33]。

微環(huán)境能在一定程度上影響血管形成，極低頻電磁場處理可以促進人工皮膚快速形成血管結構,而且促進新血管受體的血管結構相吻合[34]。

3.2 成纖維細胞

纖維蛋白是細胞生長和增殖的良好三維支持，促進細胞在三維框架內的粘附和滲透，促進細胞在三維框架內的粘附和滲透，并促進細胞在毛細血管樣結構中的附著。成纖維細胞是參與傷口愈合的重要細胞，能夠分泌到一系列蛋白到三維支架的間隙中，已知這些細胞外基質分子的存在對于內皮細胞存活及其組織成微毛細管具有極其重要的作用[35]。胰島素通過多種不同的信號途徑誘導VEGF-mRNA 的表達來促進血管內皮細胞的增值，同時能促成成纖維細胞的生長及膠原合成，牛震海等[36]通過給133 只大鼠注射不同濃度胰島素,發(fā)現小劑量胰島素能有效的促進局部成纖維細胞的增殖并浸潤真皮基質。

3.3 干細胞

干細胞經過非對稱性復制分化成多種組織類型,能構建復雜組織結構，目前較理想的來源為間充質干細胞，其中脂肪源性間充質干細胞增殖和分化能力最佳,其次是來源于骨髓和軟骨的間充質干細胞[37]。脂肪源性干細胞具有來源豐富,低免疫原性,幾乎不表達MHC I 類抗原，低表達MHC II 類抗原，還具有免疫抑制特性[38]，并且體外擴增方便，分泌多種生長因子,也能通過旁分泌作用于成纖維細胞并分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白,促進表皮細胞再生,促進創(chuàng)面愈合及組織血管化[37]，被認為是再生醫(yī)學的主要候選者。Meruane MA 等[38]通過成年大鼠的腹股溝區(qū)域分離脂肪來源的干細胞接種至皮膚替代物48 小時，然后植入同一只大鼠，數據表明血管分布的增加和膠原的合成。

誘導多能干細胞（iPSC）具有巨大的潛力，Lin W 等[39]建立人類iPSCs 作為皮膚組織工程的潛在細胞來源，通過誘導具有堿性成纖維細胞生長因子的iPSC 衍生的間充質干細胞（iPSC-MSC）來獲得具有血管生成和角蛋白原分化潛能的表皮樣細胞系（bFGF）或角質形成細胞生長因子（KGF），這種具有血管生成和角質形成分化潛能的細胞系為構建良好血管化和角質化的組織工程皮膚提供了有希望的新細胞來源。

皮膚中的毛囊干細胞、毛乳頭細胞等也是有希望的細胞來源，通過明膠-軟骨素-6-硫酸鹽-透明質酸支架接種血管內皮生長因子165 修飾的毛囊干細胞能促進皮膚替代物中的血管形成[40]。劉坡等[41]用同種異體脫細胞真皮基質為支架,并在真皮乳頭側種植毛乳頭細胞的方法，證實毛乳頭細胞可促進移植皮膚替代物血管形成,能夠增加組織工程皮膚存活率。

4 基因層面

4.1 MicroRNAs

MicroRNAs 是小的非編碼RNA 片段（19-24 個核苷酸），通過增強信使RNA 的降解、阻礙mRNA 的翻譯等來影響基因的表達并控制細胞的行為，進而改變皮膚的生物活性環(huán)境；因為它的體積小、半衰期長，所以MicroRNA 能夠持續(xù)、精確的并且可控的調節(jié)細胞行為，在組織工程皮膚領域，主要是通過調節(jié)內皮細胞的遷移、增生、形態(tài)等，在促進血管形成方面起到重要作用[3]，目前認為促血管生成miR 是miR-126和miR-132，但臨床血管生成控制仍在研究中[42]。Devalliere J 等[43]使用靶向納米粒子將miR-132 轉染內皮細胞，與移植脂質到免疫缺陷小鼠相比，實驗組能使每平方毫米的微血管數量增加2 倍以上。

4.2 基因轉染

近年來，基因工程發(fā)展迅速，以轉導生物活性因子基因為主，張向榮等[44]用脂質體介導hVEGF165 基因的方式轉染人骨髓間充質干細胞,結果顯示該種人工皮膚較對照組有效促進組織工程皮膚的早期血管化及改善創(chuàng)面愈合。Xie WG 等[45]用VEGF 腺病毒載體轉染人成纖維細胞，然后將遺傳修飾的成纖維細胞接種在Integra 人造皮膚上，24 小時后Integra 貼片被移植到裸鼠的全層皮膚缺損上，結果顯示實驗組血運重建條件明顯優(yōu)于對照組。Lord MS 等[46]通過冷凍干燥制備殼聚糖支架，并裝載編碼perlecan 結構域I和VEGF189 的質粒DNA，觀察大鼠傷口愈合表明該支架具有誘導血管生成和傷口愈合的潛力。郭瑞等[47]將壓縮DNA 形成納米復合粒子，再通過物理吸附的方法負載到膠原-殼聚糖支架上,緩釋出來的TMC/DNA微粒中的DNA 由于其超螺旋結構而具有較高的細胞轉染能力，相較對照組，新生血管數和成熟血管數都得到明高提高。

5 細胞膜片技術

細胞膜片技術是指細胞在體外連續(xù)培養(yǎng)形成由細胞和細胞外基質組成的復層生長的膜片，其中細胞自分泌豐富的細胞外基質作為內源性支架，保持完整的細胞-細胞連接和細胞外基質[37]。Hasegawa A 等[48]用細胞片技術和離心技術開發(fā)了一種快速細胞片-組織制造系統(tǒng)，能保持細胞活力和組織的細胞因子生產能力，且不會出現細胞損傷，這一新系統(tǒng)將成為基于細胞片的組織工程和再生醫(yī)學領域的強大工具，并加速細胞片在臨床應用中的應用。

6 展 望

過去幾十年的組織工程皮膚領域的快速發(fā)展，已經有了顯著的成果，隨著研究的深入，相信能夠快速血管化的組織工程皮膚能夠在不久的將來生產出來。這不僅能夠解決皮源短缺的問題，同時，組織工程皮膚有助于藥物的篩選、配方開發(fā)、化學和化妝品測試以及基礎研究等。除此之外，隨著現代科學技術的發(fā)展，運用目前快速發(fā)展的科技與組織工程皮膚結合的研究也在進行中（比如電子傳感器、表皮電子等）[2]。相信這些會是未來的發(fā)展方向。