楊 瑛，魏洪媛，邵淑霞，陳曉鳴，楊子祥＊

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 南京林業(yè)大學(xué)研究生院，江蘇 南京 210037)

唾液是刺吸式昆蟲與寄主植物相互作用的重要媒介，其主要成分為唾液蛋白，并含有大量可溶性酶類[1]。唾液在昆蟲唾液腺中合成和貯存，通過取食被注入并作用于植物組織，具有克服寄主植物抗性、幫助口針穿刺、消化食物、解毒次生代謝物質(zhì)和克服寄主植物抗性等功能[2-3]。蚜蟲通過針狀口器吸食植物汁液，阻礙植物生長，導(dǎo)致植物的葉、花、芽出現(xiàn)畸形，還可能傳播病毒或者引起其他危害，是農(nóng)、林植物上的重要害蟲。五倍子蚜通過取食將唾液注入植物組織，其中的酶類或特定功能蛋白能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，引起植物組織的不正常增生，從而形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蟲癭[4-5]。

昆蟲的唾液是植物蟲癭形成和生長的關(guān)鍵物質(zhì)，是蟲癭形成的 “啟動子”[6]。與自由生長的蚜蟲相比，癭蚜通常具有?；詮?、個體數(shù)量大、局限于特定部位取食和極少造成寄主植物枯萎或死亡的特點，代表了一種獨特的昆蟲與植物相互關(guān)系的作用類型[7]。癭蚜與寄主植物不僅僅是簡單的取食與防御的關(guān)系，而是操控與適應(yīng)的關(guān)系，從某種意義上說，癭蚜與寄主植物已經(jīng)形成了一種特殊的共生關(guān)系[8]，因此，對癭蚜唾液成分的研究，不僅有助于揭示蟲癭形成機理，還可為刺吸式昆蟲與寄主植物的協(xié)同進化研究提供依據(jù)。

由于蚜蟲個體小，特定階段的生活期短，唾液蛋白收集困難和易于降解等原因，給蚜蟲唾液的提取、分離和鑒定帶來了很大困難。到目前為止，僅對豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、麥長管蚜（Sitobion avenae） 、 桃 蚜 （Myzus persicae） 和 角 倍 蚜（Schlechtendalia chinensis）等少數(shù)種類的唾液進行過研究[9-14]。這些研究均以蚜蟲為研究對象，采用雙層膜夾營養(yǎng)液模擬蚜蟲取食過程收集唾液[15]，或進一步解剖蚜蟲唾液腺提取蛋白并鑒定[16]，因此鑒定的蛋白為模擬取食注入營養(yǎng)液或唾液腺貯存的蛋白，而不是蚜蟲正常取食過程中注入植物組織的蛋白。本研究以五倍子蚜的重要種類肚倍蚜指名亞種（Kaburagia rhusicola rhusicola）（ Aphididae:Eriosomatinae: Fordini）在青麩楊（Rhus potaninii）上形成的蟲癭為材料，根據(jù)蟲癭組織的結(jié)構(gòu)特點，建立了從蟲癭組織中提取、濃縮、液質(zhì)聯(lián)用分析和鑒定唾液蛋白的方法，應(yīng)用該方法成功提取和鑒定了肚倍蚜注入蟲癭組織中的唾液蛋白。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試肚倍蚜蟲癭采自云南省昆明市金殿國家森林公園（102°48′ E，25°5′ N，H：1 980 m），為野生自然分布的肚倍蚜。于5 月初在林間采集新鮮肚倍蚜初期蟲癭，立即置于液氮罐中，帶回實驗室，轉(zhuǎn)到－80 ℃立式超低溫冰箱（Forma）保存，并進行后續(xù)處理。

1.2 肚倍蚜蟲癭處理及蛋白提取

選取直徑為3～6 mm 的初期肚倍蚜蟲癭，對其進行解剖，移除蟲癭內(nèi)部的干母和干雌，并去除蠟粉和雜質(zhì)等，用無菌水沖洗干凈。將蟲癭外壁切成小塊，沿外壁的中心線切除外表層，取蟲癭壁的內(nèi)層，將內(nèi)層切成約0.5 mm×0.5 mm 的小方塊，浸入TE-SDS 緩沖液中（10 mmol·L－1Tris，1 mmol·L－1EDTA，pH 8.0，0.1%SDS），4 ℃ 靜置1 h 以上。移除上清液，收集下層蛋白質(zhì)沉淀，置于液氮中保存?zhèn)溆?。重?fù)上述過程，解剖30～50 個蟲癭，直到收集到足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)沉淀液，用于后續(xù)電泳分離。

1.3 蛋白濃縮

1.3.1 真空冷凍干燥法 將收集的蛋白沉淀液合并于50 mL 離心管中，在－80 ℃冰箱中預(yù)冷成固態(tài)，轉(zhuǎn)移至超低溫真空冷凍干燥儀內(nèi)（ZL-12 TDT 架型），設(shè)置參數(shù)為：0.024 mbar，－54 ℃，至完全干燥成粉末狀，加入200 μL TE-SDS 緩沖液溶解，用于后續(xù)電泳檢測。

1.3.2 超濾膜濃縮法 將收集的蛋白沉淀液（500 μL）轉(zhuǎn)移到截留分子量（MWCO）10 K 的超濾管中，1 300×g，4 ℃，離心25 min。轉(zhuǎn)移沉淀液至截留分子量（MWCO）3 K 的超濾管中，1 000×g，4 ℃，離心30 min。再轉(zhuǎn)移沉淀液至1.5 mL 的離心管中，加50 μL 蛋白酶抑制劑（PMSF），超聲破碎，旋渦混勻。真空離心濃縮，30 ℃熱干30 min。最終沉淀液體積約為100 μL。

1.4 蛋白檢測

1.4.1 Bradford 法定量檢測 采用酶標板法檢測蛋白濃度，選擇Protein 程序下的Bradford 法。使用96 孔酶標板（Corning，貨號3 524），取5.0 mg·mL－1的BSA 蛋白（牛血清蛋白）為標準蛋白，用蛋白定量染料分別稀釋10、20、40、60、80、100、150 倍，每個標準品設(shè)置1 個重復(fù)，各孔分別加入20 μL 相應(yīng)濃度的標準蛋白質(zhì)溶液（200 μg·mL－1）。各酶標孔加入200 μL Bradford 工作液，迅速混勻。室溫25～30 ℃，反應(yīng)5 min 后，以0 號管為空白對照，在酶標儀上測各孔在A595 處的OD 值。以標準組各孔在A595 nm 處測定的OD 平均值為縱坐標，對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，在SPSS Statistics 17.0 軟件中繪制標準曲線。所得標準曲線為 ：y=0.007 7x+0.379 1，R2=0.997 0。 取20 μL 上述1.3 樣品濃縮液用蛋白定量染料按照10、20、40、60、80、100、150 倍的濃度梯度進行稀釋，測定A595 nm 處的OD 值，對照已經(jīng)得到的標準曲線，計算得出樣品的蛋白濃度。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 采用BIO-RAD 的垂直電泳儀， 配制濃度為12% 的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離膠，再配制5% 的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳濃縮膠。以等體積去離子水為陰性對照，5 μL 預(yù)染蛋白Marker 作為陽性對照，90 V 恒壓電泳至溴酚藍的前沿超過濃縮膠，再用120 V 恒壓電泳約1.5 h，至溴酚藍的前沿接近凝膠末端時，停止電泳。

1.5 考馬斯亮藍染色、脫色

染色：將膠塊放置在轉(zhuǎn)速約為65 r·min－1的搖床上染色1 h 左右，取出膠塊，去離子水清洗。

脫色：將染色過的膠塊放于轉(zhuǎn)速為65 r·min－1搖床上脫色1 h 以上，至膠底色干凈，條帶清晰可見即可。

1.6 凝膠攝像

將脫色的膠塊靜置于凝膠掃描板上，采用MagicScan 5. 1 進行攝像和分析。

1.7 質(zhì)譜分析

1.7.1 溶液酶解（in-solution digestion） 濃縮之后的肚倍蚜唾液蛋白用50 μL 0.1 mol·L－1碳酸氫銨溶 液 調(diào) 節(jié)pH 值 至7～8 之 間 ， 加 入1 mol·L－1的DTT（二硫蘇糖醇）至濃度為10 mmol·L－1，55 ℃恒溫金屬浴加熱1 h。再添加1 mol·L－1的堿乙酸銨至濃度為50 mmol·L－1，在室溫下，置于暗箱中靜置暗反應(yīng)1 h。接著加入0.3 μg 的胰蛋白酶溶液trypsin（TB180 索萊寶），置于37 ℃恒溫箱，培養(yǎng)15～16 h，用于質(zhì)譜檢測。

1.7.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測（LC-MS/MS） 取上述酶解產(chǎn)物，進行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。設(shè)置步驟如下：分離柱：Dr.Maisch 色譜柱（75 μm ×150 mm），流動相：乙腈和水(70：30) 為流動相進行梯度洗脫，時間：45 min，流速：200 nL·min－1，柱溫：室溫。質(zhì)譜分析在北京蛋白質(zhì)組研究中心（BPRC）進行。

1.8 蛋白鑒定

采用Mascot 搜索軟件，對上述蛋白（LC-MS/MS）的分析結(jié)果進行蛋白多序列檢索比對。搜索的數(shù)據(jù)庫為：豌豆蚜蛋白數(shù)據(jù)庫ACYPIproteinsV2.1b(http://www.aphidbase.com/aphidbase/downloads) 和擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫（ https://www.arabidopsis.org/download）。搜索參數(shù)設(shè)置：Peptide Mass Tolerance:± 0.1 Da, Fragment Mass Tolerance: ± 0.2 Da, Max Missed Cleavages: 2。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白檢測結(jié)果

2.1.1 Bradford 法定量檢測 經(jīng)Bradford 法酶標儀檢測，真空冷凍干燥法濃縮樣品的蛋白濃度為39 μg·mL－1；超濾膜濃縮法濃縮液中沒有檢測出蛋白。表明真空冷凍干燥法濃縮液中含有蛋白，且濃度已達到了質(zhì)譜分析的要求，可用于蟲癭組織中肚倍蚜唾液蛋白的濃縮。

2.1.2 聚丙酰胺凝膠電泳檢測（SDS-PAGE） 經(jīng)垂直板電泳檢測，超濾膜濃縮樣品的膠塊，考馬斯亮藍染色時沒有明顯條帶；真空冷凍干燥法濃縮液樣品，考馬斯亮藍染色有微弱的蛋白條帶，表明所收集肚倍唾液蛋白提取液的蛋白濃度較低。

2.1.3 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析（LC-MS/MS） 經(jīng)LC-MS/MS 分析，真空冷凍干燥法濃縮樣品的質(zhì)譜圖上有蛋白質(zhì)峰（圖1），表明提取的蛋白已經(jīng)達到了質(zhì)譜分析的要求，可以進行蛋白種類鑒定與分析；超濾膜濃縮法得到的產(chǎn)物沒有蛋白質(zhì)峰。

2.2 蛋白鑒定

考馬斯亮藍染色膠塊沒有出現(xiàn)明顯的條帶，因此選擇做溶液酶解，將質(zhì)譜分析結(jié)果與豌豆蚜蛋白數(shù)據(jù)庫和擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫分別進行比對檢索，分別鑒定出5 種和7 種，共計12 種蛋白，分子量介于30.9～157.6 kDa，匹配的肽段數(shù)為1～4 條，編碼氨基酸長度為277～1 421（表1）。經(jīng)過文獻檢索與蛋白功能分析，在豌豆蚜蛋白庫檢索的5 種蛋白質(zhì)中，其中編號ACYPI 006711 的為延伸因子蛋白，具有GTP 蛋白結(jié)合功能，該蛋白在角倍蚜（S. chinensis）的唾液和唾液腺中也被鑒定到；另有編號ACYPI 006969 的為Actin 蛋白，為細胞骨架結(jié)構(gòu)功能蛋白，在角倍蚜唾液腺中也被鑒定到[14]，其它的2 種分別為組蛋白、黏合連接蛋白，具有核小體DNA 結(jié)合和磷脂酸結(jié)合功能；另1 種為松脂蛋白或記憶蛋白，具有mRNA 分離或剪切功能。由于ACYPI 006711 和ACYPI 006969 蛋白在與肚倍蚜親緣關(guān)系相近的角倍蚜唾液或唾液腺中存在（圖2），并具有與蟲癭誘導(dǎo)相關(guān)的功能，因此可以判斷從肚倍蚜蟲癭組織中鑒定的蛋白有很大的可能來自于肚倍蚜唾液，并與蟲癭的誘導(dǎo)和形成有關(guān)。而ACYPI007671、ACYPI003311 和ACYPI002474為唾液的特異蛋白，在唾液蛋白中占有較高的比例，推測它們也可能與蟲癭的形成有關(guān)，ACYPI007671和ACYPI003311 為特異結(jié)合蛋白，是完成生命活動的基本蛋白。對上述特異蛋白的功能研究，將是今后蟲癭形成機理研究的重點。從擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定出的7 種蛋白， 分別為跨膜蛋白、ATP 合成蛋白、熱激蛋白、伴侶蛋白和磷酸羧化酶蛋白等，其功能包括磷脂酸結(jié)合、ATP 結(jié)合與合成、蛋白轉(zhuǎn)運、蛋白乙酰化、卡爾文循環(huán)和CO2固定等，這些蛋白可能是在蟲癭組織切割過程中，從組織細胞間溶解的蛋白，其功能可能與寄主植物組織的基本組成或植物組織增生和生長等相關(guān)。

圖1 從蟲癭組織提取的肚倍蚜唾液蛋白的LC-MS/MS 圖Fig. 1 MS spectrogram of saliva proteins from gall tissue of K. rhusicola rhusicola

表1 從蟲癭組織中鑒定的所有蛋白種類及特征 Table 1 All protein types and characteristics of K. rhusicola rhusicola identified from gall tissue

圖2 肚倍蚜唾液蛋白與角倍蚜唾液和唾液腺蛋白的比較韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of saliva and salivary gland proteins identified from K.rhusicola rhusicola and S. chinensis

3 討論

昆蟲唾液的收集是唾液研究中最重要的環(huán)節(jié)，是唾液蛋白鑒定的基礎(chǔ)。已有的對五倍子蚜唾液蛋白的研究包括采用雙層膜夾營養(yǎng)液模擬蚜蟲取食過程收集干母的唾液[15]，或采取解剖干母唾液腺提取和鑒定蛋白[16]，鑒定出的蛋白為唾液腺中貯存的蛋白或模擬取食注入營養(yǎng)液中的蛋白，并不是五倍子蚜自然取食注入蟲癭組織的唾液蛋白，唾液腺是唾液的合成和儲存場所，五倍子蚜通過口針在蟲癭內(nèi)壁取食時，會隨著食物的不同注入不同種類的蛋白，目前還沒有從蟲癭組織中鑒定倍蚜唾液蛋白的相關(guān)報道。本研究以肚倍蚜初期蟲癭為材料，根據(jù)肚倍蚜蟲癭結(jié)構(gòu)和取食特性等，對植物組織中提取昆蟲唾液蛋白的方法進行改進[17]，成功從蟲癭組織中提取和鑒定了肚倍蚜部分唾液蛋白。

肚倍蚜干母在青麩楊葉片上取食，刺激葉片不正常增生形成囊狀蟲癭，將干母包裹在封閉的蟲癭內(nèi)，干母在蟲癭內(nèi)壁繼續(xù)取食，刺激蟲癭進一步增生膨大。干母和干雌（干母后代）口針很短，僅為0.3 mm 左右，一般只能在蟲癭內(nèi)壁表層間取食[18-19]。本研究將蟲癭內(nèi)壁切成小方塊后，細胞間的唾液蛋白會溶解到緩沖液中，而癭壁組織的蛋白由于有細胞壁的束縛，一般不會輕易溶解到緩沖液中，這樣就避免了肚倍蚜唾液蛋白和蟲癭組織蛋白的混合或覆蓋，從而可以提取到純度較高的肚倍蚜唾液蛋白。

唾液蛋白提取液的濃縮是蛋白分析和鑒定的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從肚倍蚜蟲癭組織中析出的肚倍蚜唾液蛋白，量不僅少且濃度低，需要經(jīng)過濃縮才能達到質(zhì)譜分析的要求，本研究分別采用超濾膜法與冷凍干燥法進行濃縮，結(jié)果表明，冷凍干燥法適合蟲癭組織內(nèi)肚倍蚜唾液的提取，是唾液濃縮的有效方法。

對于刺吸式昆蟲而言，其唾液通常是在唾液腺內(nèi)合成和貯存，并在取食過程中通過口針將唾液蛋白注入寄主植物組織中。有研究表明，昆蟲唾液的成分會由于食物的不同而變化，表明昆蟲唾液中的酶類與食物的種類相互關(guān)聯(lián)[20-23]，因此，解剖唾液腺或采用雙層膜夾營養(yǎng)液法模擬昆蟲取食獲得的唾液蛋白，與昆蟲自然取食寄主植物分泌的唾液蛋白存在著差異。蚜蟲唾液收集時采用的雙層膜夾營養(yǎng)液法，其營養(yǎng)液的選擇極大多數(shù)為蔗糖溶液或蒸餾水[24-26]；而當肚倍蚜（干母）在蟲癭內(nèi)壁刺吸取食時，食物來源為植物木質(zhì)部或韌皮部篩管中的汁液。兩種食物來源差異甚大，唾液的成分也將隨之發(fā)生變化，其唾液蛋白種類也會有所不同。本研究從蚜蟲取食的蟲癭組織中分離和鑒定唾液的蛋白，是蚜蟲自然取食過程中分泌的唾液蛋白，可為研究昆蟲與寄主植物互作提供依據(jù)。本研究從肚倍蚜取食的蟲癭組織中分離和鑒定到部分唾液蛋白，與已知的角倍蚜唾液蛋白（ 31 種） 及唾液腺蛋白（141 種）進行比較分析（圖2），結(jié)果顯示與角倍蚜唾液腺蛋白存在1 個共有蛋白：ACYPI 006711；三者還存在1 個共有蛋白：ACYPI 006969。蟲癭組織中肚倍蚜唾液蛋白與角倍蚜唾液蛋白和唾液腺蛋白中共有蛋白的存在，反映了五倍子蚜唾液蛋白在唾液腺中合成和貯存、并通過模擬取食和自然取食將唾液蛋白注入營養(yǎng)液或植物組織的過程。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用LC-MS/MS 方法從蟲癭組織中鑒定出12 種蛋白，其中編號為ACYPI 006711 的為延伸因子蛋白，在角倍蚜的唾液和唾液腺中也被鑒定到；編號為ACYPI 006969 的為Actin 蛋白，在角倍蚜唾液腺中也被鑒定到。表明從肚倍蚜蟲癭組織中鑒定的蛋白有很大的可能來自于肚倍蚜唾液，為深入探索致癭昆蟲唾液蛋白作用于寄主植物和蟲癭形成過程提供了新的方法和參考。