王康旭，吳學友，陶冶心，陳二虎，唐培安

（南京財經(jīng)大學 食品科學與工程學院，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

印度谷螟Plodia interpunctella(Hübener)是世界性的鱗翅目儲糧害蟲，能夠危害稻谷、小麥、玉米、干果、藥材和多種作物種子的生產(chǎn)和儲藏[1]。傳統(tǒng)防治方法具有抗性發(fā)生普遍、殘留風險高等缺點，嚴重威脅了糧食和食品安全的有力保障[2]。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻，是指將非水稻來源的抗蟲基因?qū)胨倔w內(nèi)所培育出的新型水稻品種[3]。其中的抗蟲基因大多來源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt），這是因為 Bt在其形成芽孢的過程中會產(chǎn)生具有殺蟲效果的晶體蛋白（cry）[4]，在借助基因工程的方法后，可以在水稻中大量表達此類殺蟲蛋白，賦予作物抗蟲性[5]。研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因水稻對多種鱗翅目昆蟲均具有良好的防治效果，例如稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、印度谷螟和二化螟Chilo suppressalis等[6-7]。

保護酶是昆蟲體內(nèi)最主要的生理生化相關(guān)酶系之一，主要包括過氧化物酶（peroxidase, POD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）等[8]。一般而言，生物體中的保護酶會長期處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，使游離自由基保持在一個較低水平狀態(tài)，以避免自由基對機體的破壞，起到保護作用。但是，一旦生物體內(nèi)的保護酶平衡被打破，機體就可能受到自由基的傷害。同時研究表明，當昆蟲取食Bt毒蛋白后，體內(nèi)保護酶的平衡會遭到破壞，過量的自由基會損傷機體。此時昆蟲為了保護和維持機體的正常功能就會升高保護酶活性，從而影響害蟲的生理狀態(tài)[9]。

前期研究表明，在短期取食轉(zhuǎn)Bt稻谷后，印度谷螟體內(nèi)的三種保護酶活力呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但是長期取食轉(zhuǎn) Bt稻谷及其制品后害蟲體內(nèi)的保護酶活力狀態(tài)尚不清楚，影響了害蟲對轉(zhuǎn)Bt作物的相關(guān)毒理機制研究[10-11]。本實驗以印度谷螟幼蟲為試蟲，利用轉(zhuǎn)Bt稻谷為原料制取得到的大米粉為飼料，對試蟲進行長期喂食處理，通過酶活分析方法研究了印度谷螟幼蟲在長期取食轉(zhuǎn) Bt水稻制品后體內(nèi)的保護酶活性變化。本研究不僅有利于揭示轉(zhuǎn)Bt稻谷對于印度谷螟作用的生理生化機理，還可以為相關(guān)毒理學機制提供深入研究依據(jù)，有利于轉(zhuǎn)基因稻谷的安全儲藏和合理利用。

1 材料與方法

1.1 供試水稻及蟲源

稻谷華恢1號：通過基因槍法介導，將融合抗蟲基因Cry1Ab/Cry1Ac導入非轉(zhuǎn)基因水稻品系明恢63獲得的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻，由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供，標記為HH/Bt。

稻谷明恢63：為轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻華恢1號的非轉(zhuǎn)基因親本對照，標記為MH/CK。

實驗所采用的印度谷螟品系采自江蘇省吳江市，用完全不含 Bt毒素（明恢 63）的大米粉在實驗室內(nèi)連續(xù)喂養(yǎng)2年，作為敏感種群。飼養(yǎng)條件為：溫度(30±0.5) ℃、濕度70%～80%、黑暗條件培養(yǎng)。

1.2 儲藏條件

將新收獲的轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（HH/Bt）樣品從低溫貯藏室中取出，恢復至室溫后，經(jīng)除雜后，分裝在5 L廣口瓶中，蓋緊橡膠塞，并用石蠟密封瓶口，置于(25±1) ℃人工氣候箱中儲藏，每隔30 d取樣一次，檢測水分和Bt蛋白含量。供試稻谷明恢63（MH/CK）做同樣處理。

1.3 水分測定

稻谷樣品的水分測定按照 GB 5009.3—2016直接干燥法進行。

1.4 Bt蛋白含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。測定時，將稻谷提取物加入到已經(jīng)由Cry1Ab/Cry1Ac蛋白抗體包被的微孔板中，抗體同樣品提取物中的目標蛋白進行作用，之后加入辣根過氧化物酶標記（HRP-labeled）的Cry1Ab/Cry1Ac二抗，進行檢測。產(chǎn)物在 450 nm處有吸收峰，且產(chǎn)物顏色與OD值在一定范圍內(nèi)呈正比，因此，可根據(jù)標準曲線求得樣品Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量。

1.5 試蟲處理

將不同質(zhì)量的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉摻入普通米粉中，充分攪拌混勻，配制成含量為50、100、200、400 mg/g的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉的飼料。取實驗室長期培養(yǎng)的印度谷螟5齡幼蟲若干只，饑餓處理24 h后作為供試蟲體。所有試蟲分為3組。置于2 cm直徑的培養(yǎng)盒中，每個培養(yǎng)盒接種一頭，分別用含有0、50、100、200、400 mg/g的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉飼養(yǎng)12 d后取樣。另外，我們從敏感種群中隨機挑選了部分試蟲，在含有50、100 mg/g轉(zhuǎn)基因大米粉的飼料中連續(xù)篩選培養(yǎng)5個月后取樣。所有樣品冷凍保存于–80 ℃冰箱中，用于酶源制備。

1.6 酶源制備

待勻漿的印度谷螟幼蟲經(jīng)過流動的純凈水沖洗后，用濾紙將表面水分吸干。對幼蟲進行稱重，置于試蟲9倍重的0.9%的低溫生理鹽水的玻璃勻漿器中進行研磨，之后將勻漿液在 2 000～3 000 r/min下低溫離心15 min，取離心后上清液作為待測酶源，置于–80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗重?次。

1.7 酶源蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍G–250法測定待測酶源中的總蛋白含量，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白進行計算。

1.8 酶活性測定

本實驗采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的SOD、POD和CAT活力檢測試劑，按試劑盒說明進行操作。被測樣品的抗氧化酶活性計算公式如下：

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用GraphPad軟件LSD方法進行方差分析，重復數(shù)據(jù)計算其平均值和標準誤（SE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷水分含量變化

儲藏前，HH/Bt和MH/CK稻谷的初始水分分別為13.31%和13.18%，無顯著差異（P>0.05）。在隨后的270 d儲藏期內(nèi)，對HH/Bt稻谷的水分含量進行的檢測分為糙米和稻殼兩部分進行，結(jié)果見圖1。從HH/Bt稻谷的糙米和稻殼水分變化趨勢可以看出，隨著儲藏時間增加，其水分含量在逐漸降低，在270 d的儲藏期內(nèi)，HH/Bt糙米水分由儲藏前的13.31%下降至12.46%，HH/Bt稻谷稻殼的水分由儲藏前的10.11%下降至8.54%。

圖1 儲藏期內(nèi)HH/Bt稻谷（糙米和稻殼）水分變化

2.2 Bt蛋白標準曲線

以 1.8×10–2、1.5×10–2、1.0×10–2、5.0×10–3和1.0×10–3μg/mL 濃度梯度的Cry1Ab標準液，經(jīng)EnvirotogixCry1Ab/Cry1Ac平板試劑盒酶聯(lián)免疫反應后，在450 nm波長下，用多功能酶標儀讀取波長其OD值，繪制的標準曲線如圖2所示。

圖2 Bt蛋白標準曲線

2.3 儲藏期內(nèi)稻谷Bt蛋白含量變化

在25 ℃條件下，歷時270 d（9個月）的儲藏期內(nèi)，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白含量的變化分別如圖3、圖4所示，測定結(jié)果顯示，隨著儲藏時間的增加，HH/Bt稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白含量均降低，HH/Bt稻谷的糙米中Bt蛋白含量由儲藏前的5.534 μg/g，在儲藏90、180、270 d后分別降至4.818、4.551、4.003 μg/g。HH/Bt稻谷的稻殼中 Bt蛋白含量由儲藏前的1.003 μg/g，在儲藏90、180、270 d后分別降至0.839、0.672、0.328 μg/g。在 270 d的儲藏期內(nèi)，HH/Bt稻谷的稻殼中Bt蛋白的自然降解率較糙米中的大，HH/Bt稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白降解率分別為27.7%和67.3%。

圖3 儲藏期內(nèi)HH/Bt稻谷的糙米中Bt蛋白含量變化

圖4 儲藏期內(nèi)HH/Bt稻谷的稻殼中Bt蛋白含量變化

儲藏期內(nèi)HH/Bt稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白含量的差異分析結(jié)果表明，隨著儲藏時間的延長，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白的含量顯著下降（P<0.05），儲藏60、240 d后，糙米和稻殼中Bt蛋白含量分別為4.930、4.067、0.842、0.623 μg/g。同一儲藏期，對糙米和稻殼中的 Bt毒蛋白含量的差異分析結(jié)果表明，儲藏前（0 d）轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白的含量差異極顯著（P<0.05），儲藏270 d后，該轉(zhuǎn)基因稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白含量差異仍極顯著（P<0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)Bt基因大米粉對印度谷螟幼蟲體內(nèi)SOD活性的影響

轉(zhuǎn) Bt基因大米粉對印度谷螟幼蟲體內(nèi) SOD的影響如圖5所示。在用不同濃度的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉飼喂印度谷螟幼蟲12 d后，其體內(nèi)SOD活性隨著取食飼料中轉(zhuǎn) Bt基因水稻濃度的上升而下降，在取食400 mg/g轉(zhuǎn)Bt基因水稻后，SOD活性與對照相比差異達到最大，下降了 28.4%。另外，圖6顯示了用50、100 mg/g的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉持續(xù)飼養(yǎng)印度谷螟5個月后，對試蟲種群體內(nèi)的SOD活性進行測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)取食含有50、100 mg/g的轉(zhuǎn)基因大米粉飼料的印度谷螟種群的SOD活性與對照相比分別下降了10.33%、38.75%，該結(jié)果與12 d的飼養(yǎng)處理結(jié)果趨勢基本一致。深入分析認為，在長期取食轉(zhuǎn)Bt基因大米粉后，幼蟲體內(nèi)的SOD活性明顯受到抑制，并且取食的飼料中轉(zhuǎn)基因大米粉含量越高，SOD活性抑制效果越顯著。這說明，長期取食轉(zhuǎn)Bt基因水稻后，Bt毒蛋白可能會抑制SOD對體內(nèi)O2–的清除。

圖5 不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)印度谷螟幼蟲12天對其SOD酶活力的影響

圖6 由不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)5個月后的印度谷螟種群體內(nèi)的SOD活性

2.5 轉(zhuǎn)Bt基因水稻對印度谷螟幼蟲體內(nèi)POD活性的影響

在用不同含量的轉(zhuǎn)Bt基因水稻飼喂印度谷螟幼蟲12 d后，其體內(nèi)POD活性變化的情況如圖7所示，取食轉(zhuǎn) Bt基因水稻后，幼蟲體內(nèi)的 POD活性顯著升高，且隨著飼料中轉(zhuǎn)Bt基因水稻濃度的上升而下降，但始終高于對照組。圖8表明利用不同含量的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉飼料飼養(yǎng)5個月的印度谷螟種群，其幼蟲體內(nèi)的POD活性進行測定的結(jié)果，該結(jié)果與12 d的飼養(yǎng)結(jié)果一致，通過轉(zhuǎn)基因大米粉的POD活性高于對照組。由此可見，在利用轉(zhuǎn)基因大米粉長期飼養(yǎng)印度谷螟后，其體內(nèi)的POD活性明顯升高，說明其抵抗Bt毒素的能力顯著增強，通過提高試蟲體內(nèi)的POD活性以維持細胞內(nèi) H2O2的動態(tài)平衡。然而攝入高濃度Bt毒素的幼蟲體內(nèi)POD活性比攝入低濃度的低，這可能是由于印度谷螟幼蟲對低濃度Bt毒素具有更快更強的適應性，形成了較為完善的防御系統(tǒng)。

圖7 不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)印度谷螟幼蟲12天對其POD活性的影響

圖8 由不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)5個月后的印度谷螟種群體內(nèi)的POD活性

2.6 轉(zhuǎn)Bt基因水稻對印度谷螟幼蟲體內(nèi)CAT活性的影響

由圖 9可以看出，在印度谷螟幼蟲取食轉(zhuǎn)基因大米粉含量>50 mg/g的大米粉飼料后，其體內(nèi)的CAT活性均顯著高于對照組，且隨著Bt大米粉含量的增加，CAT活性呈增加趨勢。圖10表明利用不同含量的轉(zhuǎn)Bt基因大米粉飼料飼養(yǎng)5個月的印度谷螟種群，其體內(nèi)CAT活性的變化。在長期攝入Bt毒素后，幼蟲體內(nèi)的CAT活性均顯著高于對照組。

由此可見，在印度谷螟幼蟲長期取食含有 Bt大米粉的飼料后，其體內(nèi)CAT活性會發(fā)生上調(diào)，可能可以借此來清除體內(nèi)過量的H2O2，從而維持細胞內(nèi)游離自由基的相對穩(wěn)定，以抵抗Bt毒素的脅迫。

圖9 不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)印度谷螟幼蟲12天對其CAT活性的影響

圖10 由不同含量轉(zhuǎn)基因大米粉飼養(yǎng)5個月后的印度谷螟種群體內(nèi)的CAT活性

3 討論

本試驗針對 25 ℃?zhèn)}儲條件下，水分含量為13%的轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（HH/Bt）進行為期270 d的儲藏研究，研究表明，隨著儲藏時間的增加，HH/Bt稻谷的糙米和稻殼的水分在逐漸降低，HH/Bt稻谷的糙米和稻殼中Bt蛋白含量顯著下降；同一儲藏期，HH/Bt稻谷的糙米中Bt蛋白含量顯著高于稻殼。林鎮(zhèn)清等[12]以早秈稻為材料，進行高大平房倉儲藏，跟蹤測定了2006年3月至2008年7月期間，倉中稻谷水分含量的變化，指出質(zhì)量好的稻谷，在控溫、控濕較為理想的倉房內(nèi)，稻谷水分會隨著儲藏時間的延長而逐漸降低。本文對轉(zhuǎn)基因稻谷的水分變化研究結(jié)果與其所得結(jié)論相一致。

謝小波和舒慶堯等[13]對美國一龍公司（Envirotogix）開發(fā)的Cry1Ab/Cry1Ac平板試劑盒用于轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻中 Bt蛋白含量測定進行了評估，指出該試劑盒具有良好的檢測靈敏度和快速的特點，其最低 Bt蛋白檢測濃度為0.5 ng/g。本試驗所采用的試劑盒是 Envirotogix在原Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒基礎上加以改進以適合轉(zhuǎn)基因稻谷檢測之用。Tu等[14]開發(fā)的轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻估測其Bt蛋白表達量占總可溶蛋白的 0.01%～0.20%，為高表達水平，繼而開發(fā)的該轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻明恢 63（T51–1）Bt蛋白含量高達 20 μg/g[15]。姜永厚等[16]對轉(zhuǎn)Cry1Ab基因克螟稻 1號（親本為秀水11）孕穗期和成熟期的莖稈中Bt蛋白含量測定結(jié)果分別為43.20、22.27 μg/g，而吳立成[17]對成熟期該轉(zhuǎn)基因水稻地上部分 Bt蛋白含量測定結(jié)果為 7.98 μg/g。Bashir等[18]對轉(zhuǎn)Cry1Ac和Cry2A的印度香米收獲10 d后的子粒中Bt含量測定結(jié)果分別為 0.3、0.26 μg/g。陳浩[19]測定的轉(zhuǎn)Cry1Ac、Cry2A*、Cry9C*基因的水稻明恢 63（TAC–2、T2A–1、T9C–3）成熟種子中Bt蛋白的含量分別為 8.15、12.98、20.10 μg/g。對于上述所測定的Bt蛋白的差異，親本水稻性狀、構(gòu)建的基因、啟動子、生長環(huán)境等都會影響到轉(zhuǎn) Bt基因水稻中Bt蛋白的表達水平。

自然環(huán)境儲藏條件下，趙文娟[20]的對轉(zhuǎn)Cry1Ac/SCK基因Ⅱ優(yōu)MS67的Bt蛋白含量進行連續(xù)9個月監(jiān)測結(jié)果顯示，Bt蛋白含量在1.262～1.593 μg/g，且在前期儲藏中蛋白降解較快，后期降解速度趨于平緩。轉(zhuǎn)Bt基因谷物中的Bt蛋白降解途徑有：自身代謝分解、光照、微生物分解等。宋偉等[21]的研究指出在25 ℃，13.5%水分含量的儲藏稻谷中，霉菌等微生物的數(shù)量相對較少。本文模擬25 ℃、無光照的倉儲條件，研究HH/Bt稻谷對 Bt蛋白的自身代謝分解，對轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷270 d的儲藏中，糙米和稻殼中的Bt蛋白的自然降解規(guī)律與前述報道呈一致性。

隨著轉(zhuǎn)基因作物的推廣和應用，研究人員對Bt伴胞晶體蛋白的相關(guān)殺蟲機理已進行了詳盡的研究，在相關(guān)害蟲取食轉(zhuǎn)Bt作物后，害蟲機體會產(chǎn)生相應的應激反應，導致了系列代謝變化，若Bt毒素刺激能夠控制在范圍內(nèi)，蟲體可以通過調(diào)整對應的代謝功能以適應相應的代謝影響，若刺激強度超過蟲體的代謝能力時，會影響害蟲的生理狀態(tài)。所以，我們可以通過研究昆蟲體內(nèi)酶系的變化情況來分析Bt毒素的相關(guān)毒理學機制。昆蟲體內(nèi)廣泛存在以SOD、CAT和POD為代表的保護酶系統(tǒng)，能夠保護昆蟲機體免受自由基損傷，在昆蟲多種生理生化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[11]。本試驗研究了印度谷螟取食轉(zhuǎn)Bt大米粉后，其體內(nèi)的主要保護酶的對應變化，深入探究了害蟲長期攝入Bt毒蛋白與其機體代謝情況的對應關(guān)系。

在轉(zhuǎn)Bt水稻短時誘導培養(yǎng)中，印度谷螟幼蟲體內(nèi)SOD活力上升，而CAT和POD的活力低于對照，受到了抑制，說明印度谷螟作為轉(zhuǎn)Bt基因水稻的靶標害蟲，Bt毒蛋白被幼蟲攝入后，短期內(nèi)可擾亂幼蟲SOD，CAT和POD保護酶系統(tǒng)的動態(tài)平衡，對害蟲機體產(chǎn)生毒害作用。本試驗在此基礎上研究了印度谷螟長期取食不同含量轉(zhuǎn)Bt基因大米粉12 d及連續(xù)篩選飼養(yǎng)5個月后，其體內(nèi)保護酶的變化情況，該結(jié)果與轉(zhuǎn)Bt基因稻谷短期飼喂幼蟲結(jié)果顯著不同。在長期喂食試驗中，我們發(fā)現(xiàn)SOD活性顯著低于對照組，而POD和CAT的活性高于對照組。這說明印度谷螟幼蟲在較為長期取食Bt毒蛋白的過程中，自身形成了較為完善的防御系統(tǒng)，可能通過提高 POD和 CAT的活性來實現(xiàn)H2O2、氧化酚類和胺類化合物的催化反應，從而有效清除了體內(nèi)H2O2和酚類、胺類物質(zhì)毒性[11]。而長期喂食后，SOD活性仍然受到了抑制，這說明三種保護酶的表達調(diào)控機制可能存在一定的差異，蟲體通過POD和CAT活性的提高以彌補SOD活力的下降，以保護和維持機體進行正常的代謝，使試蟲對Bt毒素產(chǎn)生了一定的耐受性，但是保護酶的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡還有待進一步探索。另外，我們還對取食轉(zhuǎn)基因大米粉后的印度谷螟生長發(fā)育情況進行了系統(tǒng)性探索[23]，同時，還利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對取食轉(zhuǎn)基因大米粉后的印度谷螟中的差異表達基因進行了分析[24]，相關(guān)結(jié)果將同本文研究一道為揭示 Bt毒素的抗性機理以及毒理學效應奠定了理論基礎。