呂泓霖，許成梅，陳 丹，馬雅鴿，陳朝銀，趙聲蘭

（1. 云南中醫(yī)藥大學，昆明 650500；2. 云南省煙草監(jiān)測站，昆明 650106；3. 云南經濟管理學院，昆明 650106）

學習和記憶是腦的重要機能之一，改善和延緩學習記憶能力減退是人類追求強大和健康的方向和手段之一[1]。記憶力減退的產生是外界因素影響與人體功能紊亂交互作用所致，現(xiàn)代社會飲食結構變化，精神壓力增大，使腦代謝紊亂，導致記憶力下降。同時隨著人口老齡化，老年人口比例增加，我國60歲以上的人口中，有70%～80%伴有不同程度的健忘和老年癡呆。目前臨床上藥物對老年癡呆導致的學習記憶障礙的治療效果不理想[2]，因此，早期預防和干預老年癡呆是目前研究的重點之一[3-4]。

核桃又名胡桃、羌桃，系胡桃科 （Juglandaceae）的核桃屬（JuglanLinn.）、山核桃屬（Carya）、緣核桃屬（Annamocarya） 等果木兼用植物[5]。我國核桃種植面積和產量均居世界第一，有豐富的核桃資源[6]。核桃仁含油脂58.8%，富含w–6和w–3脂肪酸以及神經酸、鱈油酸、角鯊烯、植物固醇、多酚等功能性成分[7]。其中核桃多酚往往隨加工副產物被廢棄，造成資源浪費，核桃多酚類化合物主要是酚酸和單寧類，以及少量的黃酮類化合物。核桃被歷代醫(yī)家稱為藥食同源的健腦益智佳品[8]，本文基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術研究核桃改善學習記憶的物質基礎和潛在作用機制[9]，為云南豐富核桃資源的利用提供新思路，也為核桃改善記憶的產品開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

網(wǎng)絡藥理學打破了藥物–單一靶標的研究方式，通過進行多層次網(wǎng)絡構建，得到藥物–靶點–疾病復雜的網(wǎng)絡關系，從整體探索中藥多成分與靶點的作用關系。其中中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）包含中國藥典中的499種中藥，共29 384種成分，3 311種靶點，837種相關疾病。Geencard是人類基因綜合數(shù)據(jù)庫，包含基因組、蛋白組、轉錄、遺傳和功能上的基因。OMIM提供已知遺傳疾病的相關基因信息。STRING是搜索已知蛋白相互關系的數(shù)據(jù)庫，是覆蓋物種最多，相互作用信息最全的。DAVID是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，其整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表（成百上千個基因ID或者蛋白ID列表）提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。CB-Dock分子對接在線平臺的特點是可以預測給定蛋白質的結合位點[10-11]。

1 數(shù)據(jù)來源及分析方法

1.1 核桃活性成分及作用靶點的收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP），輸入關鍵詞“Walnut”檢索，口服生物利用度是藥物篩選的關鍵參數(shù)[12]，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥15%進行篩選[13]，得到核桃的主要化學成分，并匹配相應的作用靶點。

1.2 記憶靶點的收集

采用綜合性人類基因數(shù)據(jù)庫（Geencard）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）輸入“memory”為關鍵詞，以評分≥5篩選記憶相關的靶點[14]，刪除重復的靶點，得到改善記憶的關鍵靶點。

1.3 核桃化合物–靶點的網(wǎng)絡構建

將核桃活性成分對應的靶點和記憶相關的靶點進行比較，獲得二者共有的靶點[15]，然后使用Cytoscape3.7.1圖形化網(wǎng)絡分析和編輯的軟件，進行“核桃活性化合物–記憶靶點”的網(wǎng)絡構建。在網(wǎng)絡中，節(jié)點表示核桃活性成分、記憶相關靶點。網(wǎng)絡中的邊用來連接藥物與活性成分、活性成分與關鍵靶點，疾病與關鍵靶點。在網(wǎng)絡中一個節(jié)點的度表示和節(jié)點相連的條數(shù)，度值越大說明這個節(jié)點越可能是關鍵節(jié)點[16]。

1.4 GO功能富集和KEGG信號通路分析

利用 DAVID數(shù)據(jù)庫對核桃改善記憶的靶點進行GO功能富集和KEGG通路分析[17]，以統(tǒng)計學超幾何分布定量評估相關性，設置P<0.05，并將富集結果進行圖表可視化[18]。

1.5 蛋白互做網(wǎng)絡的構建

STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，為了闡述核桃改善記憶蛋白的相互作用關系，將 1.3得到核桃改善記憶靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“人”，該數(shù)據(jù)庫可以對蛋白質的相互作用關系進行打分，分值越高表明相互作用的置信度高[19]，本文將相互作用評分設置為中置信度（0.400），得到核桃改善記憶蛋白的相互作用關系（PPI）。

1.6 分子對接驗證

為了確定網(wǎng)絡藥理學預測核桃改善記憶靶點的準確性，采用分子對接進行驗證。將蛋白互作網(wǎng)絡中評分較高的蛋白與KEGG結果中靠前的通路進行比較分析，得到準備驗證的關鍵靶點，將靶點輸入 PDB數(shù)據(jù)庫，選擇最佳的蛋白晶體結構，并從 PubChem數(shù)據(jù)庫中下載核桃化學成分3D結構式。將關鍵靶點的蛋白結構、核桃主要成分結構式導入到CB-Dock在線平臺進行分子對接，預測潛在蛋白質的結合位點，并根據(jù)空腔大小排序選擇幾個得分最大的空腔，設置空腔的中心，調整空腔尺寸，之后用 AutoDock Vina程序進行分子對接[20-21]。

2 結果與分析

2.1 核桃活性成分及靶點篩選結果

從中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）得到核桃化學成分共 20種（見表 1），其中口服生物利用率、血腦屏障透過率、成藥性較好的有methyl- octadecanoate（十八碳酸甲酯）類等成分。生物利用度較低的如 Cornustannin 2（山茱萸鞣質），一般不宜口服給藥，可注射給藥；血腦屏障透過率較低的如pentagalloylglucose（五沒食子酰葡糖）等可通過修飾和劑型選擇加以提高；成藥性較低的如 Casuarictin（木麻黃素）則可通過包埋、乳化等適當方法加以調整。

表1 核桃活性成分信息

2.2 記憶相關的靶點

采用人類基因疾病相關的數(shù)據(jù)庫（Geencard）和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM），收集與記憶有關的靶點[22]，選擇得分≥5的靶點[23]，得到 5 559個記憶相關的靶點。

2.3 藥物–疾病靶點預測結果

將核桃活性成分的作用靶點與記憶相關靶點進行匹配，得到38個共有靶點，對應的核桃活性成分8個（見表2）。

構建“中藥化合物–作用靶點”網(wǎng)絡[24]，如圖1，網(wǎng)絡中共有48個節(jié)點，91條相互作用的邊。通過 Cytoscape計算網(wǎng)絡參數(shù)，得到核桃活性成分和靶點作用關系[25]，核桃中化學成分按節(jié)點度值排序由高到低依次是 ellagic acid（鞣花酸）、euprostin A、Pentagalloylglucose（沒食子酰葡萄糖）、juglone（胡桃醌）、Juglanin（胡桃苷）、Methyl 9-cyclopropylnonanoate（9–環(huán)丙基壬酸甲酯）。這些化學成分是核桃改善記憶的物質基礎。同時節(jié)點度值較高的靶點是 PTGS2（前列腺素環(huán)氧合酶）、PRKCB（蛋白激酶Cβ型）、PRKCA（蛋白激酶 Cα型）等，提示核桃改善記憶是多成分、多靶點共同作用。

表2 核桃活性成分的改善記憶的靶點

圖1 核桃活性成分–記憶靶點網(wǎng)絡圖

2.4 核桃改善記憶靶點的GO功能分析

通過對核桃改善記憶的38個靶點進行GO富集分析，其中生物學功能富集排名靠前的有蛋白激酶C活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白的活性，以及核受體活性、轉錄因子活性、煙酰胺–腺嘌呤二核苷酸磷酸結合、血紅素結合、類固醇激素受體活性（見表3），這些GO功能可能是核桃改善記憶的重要生物學過程。

2.5 核桃改善記憶靶點的通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對核桃改善記憶的關鍵靶點進行 KEGG通路富集分析（P<0.05），篩選前20條記憶相關通路（見表4），主要涉及到IL–17信號通路、松弛素信號通路、血管平滑肌收縮、血管內皮生長因子信號通路、NF–κB信號通路、低氧誘導因子1信號通路、5–羥色胺能突觸、鞘脂信號通路、內分泌和其他因素調節(jié)鈣的重吸收、谷胱甘肽代謝、TNF信號通路等，提示核桃改善記憶的靶點分布在多條通路中，核桃改善記憶是多條通路相互作用的結果。

圖2 核桃改善記憶靶蛋白互做（PPI）網(wǎng)絡圖

表3 核桃改善記憶靶點的GO功能富集

2.6 靶標蛋白互作網(wǎng)絡構建

將核桃改善記憶的靶點輸入到 String數(shù)據(jù)庫進行分析，獲得靶點蛋白相互作用關系網(wǎng)絡圖（見圖2），共有 38個節(jié)點和164條相互作用連線，節(jié)點平均自由度為8.6。根據(jù)網(wǎng)絡節(jié)點度排序，關鍵靶點蛋白依次為VEGFA（激素區(qū)的血管內皮生長因子A）、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）、CAT（抗氧化區(qū)的觸酶）、MMP9 (基質金屬蛋白酶9）、RELA（轉錄因子p65）、PRKCB（蛋白激酶C beta II）、PRKCA（蛋白激酶Cα 型）。

2.7 分子對接驗證

蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）中評分較高的蛋白可以認為起到重要作用，將評分較高的潛在蛋白相對應的靶點與KEGG通路分析結果進行比較分析，將核桃改善記憶的潛在靶點 PRKCA（蛋白激酶Cα型）、PRKCB（蛋白激酶 Cβ型）作為分子對接的對象。導入 PDB數(shù)據(jù)庫，得到 PRKCA、PRKCB分辨率較高的蛋白結構3iw4、2i0e。在“活性成分–記憶靶點”中選擇度值較高的核桃活性成分：鞣花酸、沒食子酰葡萄糖、胡桃醌作為對接分子，在CB-Dock在線平臺進行對接，以Vina score得分來評價對接結果（見表5）。Vina是以相應的口袋參數(shù)對受體和配體進行分子對接所得到復合物的得分，這個值越低代表受體和配體親和力越高，對接結果越好。結果發(fā)現(xiàn)篩選得到的活性成分與預測的靶點均有結合，其中鞣花酸（ellagic acid）、沒食子酰葡萄糖（Pentagalloylglucose）均與PRKCA、PRKCB靶點有較強的親和力（見圖3）。

表4 核桃改善記憶靶點的KEGG通路

表5 核桃活性成分與靶點蛋白分子對接評分

圖3 主要活性成分與靶點蛋白的分子對接

3 討論

我國核桃種植面積和產量居全國第一，品種多樣，資源豐富，一直以來是藥食同源的健腦佳品。核桃可提高小鼠的學習記憶能力，可減緩D–gal模型小鼠的記憶障礙[26]。核桃改善學習記憶具有多成分、多靶點的特點，本文基于網(wǎng)絡藥理學進行分析，找到核桃改善記憶的物質基礎和重要靶點。篩選得到8個核桃的活性成分，如鞣花酸、胡桃醌、沒食子單寧等，對應38個核桃改善記憶的靶點，核桃活性成分通過協(xié)同作用與記憶相關的靶點，有前列腺素環(huán)氧合酶、蛋白激酶Cα型、蛋白激酶 Cδ和蛋白激酶 Cγ型等，其中前列腺素環(huán)氧合酶–2可以將花生四烯酸酯轉化為前列腺素H2（PGH2），前列腺素可調節(jié)大鼠海馬組織 VEGF、BDNF蛋白的表達，并可改善癡呆大鼠的記憶功能[27]，蛋白激酶C是絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶家族一員，是信號轉導通路的中心分子之一，參與調節(jié)細胞增殖、分化等多種生物代謝的功能。其在中樞神經系統(tǒng)中起重要作用[28]，PRK是突觸功能調節(jié)器，包括調節(jié)突觸合成、囊泡充填及多種神經遞質的釋放。同時活化的PKC能增加海馬乙酰膽堿的釋放[29]。此外，PKC的活化還能增強乙酰膽堿轉移酶活性，導致乙酰膽堿形成增多進而參與學習記憶的形成過程。這些核桃改善記憶的靶點涉及的生物學過程主要包括抗氧化過程的調節(jié)、蛋白激酶C的活性、配體激活的轉錄因子活性、核轉錄因子的活性等，這些生物學過程通過協(xié)同作用來改善記憶。

通過對改善記憶的靶點進行 KEGG通路富集，主要作用20條通路，如血管平滑肌收縮信號通路（調節(jié)靶點蛋白PRKCB、PRKCA等蛋白激酶家族的蛋白進行傳導）、NF–κB 信號通路、5–羥色胺能突觸、谷胱甘肽代謝等，其中MAPK信號通路（PRKCB、PRKCA等涉及到6個靶蛋白），MAPK是聯(lián)系細胞膜受體與細胞內重要調節(jié)靶目標的進化保守的酶類，可以調節(jié)AD中的標志物Tua蛋白，防止其過度磷酸化[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)Tua蛋白發(fā)生過度磷酸化是由于體內蛋白激酶引起，而促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在 Tua蛋白磷酸化中占有重要的位置[31-32]。Goldin發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK對海馬神經元樹突棘結構的形成與變化具有調控作用，此過程可能與中樞神經系統(tǒng)信息的長期存儲功能有關[33]。

本文通過網(wǎng)絡藥理學研究核桃改善記憶多靶點、多成分和多通路間復雜的相互關系，同時采用分子對接對核桃活性成分和改善記憶的潛在靶點的結合能力進行驗證，發(fā)現(xiàn)鞣花酸、沒食子酰葡萄糖均與PRKCA、PRKCB有較強的親和力。核桃作為保健食品，目前的研究主要集中在核桃產品開發(fā)的工藝上，對核桃改善記憶的功能研究還較少，本文為核桃改善記憶的物質基礎分析和作用機制的研究提供了理論基礎，為核桃全產業(yè)鏈開發(fā)提供新思路。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。