張冰倩，趙振華*，黃亞男，毛海佳，鄒明月，王誠，喻光懋，張敏鳴

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）放射科，浙江紹興 312000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）病理科，浙江紹興 312000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）心胸外科，浙江紹興 312000；4.浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，浙江杭州 310009； *通訊作者 趙振華 zhao2075@163.com

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康和生命[1-2]。近年來，肺癌的治療已經(jīng)從放化療發(fā)展到基于分子基因、靶向免疫等的個(gè)性化治療。蛋白激酶B（proteinkinase B，AKT）/磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷酸化AKT（p-AKT）是AKT 的活化狀態(tài)，參與調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖和分化等功能[3]。mTOR 是p-AKT 的直接下游信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、遷移侵襲。在腫瘤進(jìn)展中p-AKT、mTOR 表達(dá)異常升高[4-5]。AKT、mTOR 作為新的免疫治療靶點(diǎn)，相關(guān)的靶向藥物（如MK-2206、雷帕霉素等）越來越有希望運(yùn)用于肺癌的治療[6]。目前，檢測p-AKT、mTOR的方法主要依靠對(duì)腫瘤組織侵入性的穿刺取樣，由于組織標(biāo)本僅能反映局部的組織情況而不能反映整個(gè)腫瘤組織情況，尤其腫瘤較大時(shí)，往往生長不均質(zhì)，局部標(biāo)本容易產(chǎn)生誤差。本研究擬通過動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI（DCE-MRI）定量灌注直方圖參數(shù)與肺癌組織p-AKT、mTOR 表達(dá)的相關(guān)性，探討對(duì)病灶的分子病理信息進(jìn)行無創(chuàng)性、可重復(fù)性預(yù)測的可行性，為臨床選擇治療方案提供重要信息。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性收集紹興市人民醫(yī)院2017年1月—2018年4月經(jīng)肺部活檢穿刺或術(shù)后病理證實(shí)的肺癌33例，年齡50～85歲，平均（67±9）歲，其中鱗癌15例，腺癌12例，小細(xì)胞肺癌6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺部病灶直徑>2 cm；②MRI 檢查前未接受穿刺、手術(shù)、放化療、藥物治療等；③手術(shù)或穿刺活檢后經(jīng)病理確診為肺癌；排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)或穿刺與MRI 檢查間隔3個(gè)月以上；②圖像掃描質(zhì)量不佳或腫塊邊界不明確。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202063）。

1.2 MRI 檢查 采用Siemens Verio 3.0T MRI 掃描儀，體部表面相控陣線圈掃描。先行常規(guī)平掃，于動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描前進(jìn)行多翻轉(zhuǎn)角掃描，掃描參數(shù)：TE 1.17 ms，TR 3.25 ms，翻轉(zhuǎn)角5°、10°、15°，矩陣162×288，視野350 mm×282 mm，層厚5 mm，層數(shù)30，每期時(shí)間分辨率為6.5 s。動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描：翻轉(zhuǎn)角10°，掃描35個(gè)時(shí)相，其余參數(shù)同上。DCE 掃描至第3 時(shí)相時(shí)經(jīng)肘正中靜脈高壓注射釓雙胺對(duì)比劑（歐乃影），劑量0.1 mmol/kg，速度3 ml/s，然后用20 ml 生理鹽水以相同速度沖管。將翻轉(zhuǎn)角與DCE 掃描序列導(dǎo)入Omni.Kinetics 軟件，使用3D 非剛性校正技術(shù)對(duì)呼吸運(yùn)動(dòng)偽影進(jìn)行校正（圖1）。

圖1 3D 非剛性校正技術(shù)對(duì)肺癌患者DCE-MRI 掃描圖像呼吸運(yùn)動(dòng)偽影進(jìn)行校正。配準(zhǔn)前的肺動(dòng)脈時(shí)間-濃度曲線（綠線）與胸主動(dòng)脈時(shí)間-濃度曲線（藍(lán)線）擬合較差（A）；配準(zhǔn)后，肺動(dòng)脈與胸主動(dòng)脈期相-濃度曲線擬合改善，曲線更光滑（B）

1.3 圖像后處理 選用肺動(dòng)脈與支氣管動(dòng)脈雙血供動(dòng)脈輸入函數(shù)類型進(jìn)行圖像后處理，并測量數(shù)據(jù)。選擇腫瘤最大層面上下3～5個(gè)層面勾畫病灶感興趣區(qū)（ROI），避開囊變、壞死、周圍血管區(qū)以及正常肺組織，整合成1個(gè)3D ROI 進(jìn)行定量分析。最終獲得轉(zhuǎn)移常數(shù)（Ktrans）、血漿容積分?jǐn)?shù)（Vp）、速率常數(shù)（Kep）、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)（Ve）的直方圖參數(shù)（均值、偏度、峰度、均一性、能量、熵、百分位數(shù)）。由2名高年資放射科醫(yī)師進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測量3 次并取平均值。

1.4 p-AKT、mTOR 蛋白表達(dá)檢測及結(jié)果判定 手術(shù)切除或穿刺活檢標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水，采用免疫組化分?jǐn)?shù)測定染色結(jié)果[7]。免疫組化分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度分級(jí)×染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：無染色計(jì)0分，染色細(xì)胞 ≤10%計(jì)1分， 11%～50%計(jì)2分， 51%～80%計(jì)3分，染色細(xì)胞 ≥81%計(jì)4分；染色強(qiáng)度：無染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件，分類變量比較采用Fisher 確切概率法。使用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（Q1，Q3）表示，多組間比較采用Kruskal-Walls 檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。用Spearman 檢驗(yàn)分析p-AKT、mTOR 表達(dá)與各DCE-MRI定量灌注直方圖參數(shù)之間的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 不同病理亞型肺癌患者性別、年齡、體重指數(shù)及腫瘤最大徑組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 33例不同病理亞型肺癌患者一般資料比較

2.2 不同病理亞型肺癌灌注直方圖參數(shù)比較及p-AKT、mTOR 表達(dá)的差異 各灌注參數(shù)Ktrans、Kep、Ve、Vp直方圖參數(shù)在不同病理亞型組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。p-AKT、mTOR 在3 組不同病理亞型肺癌中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，P=0.037）。腺癌中p-AKT、mTOR 表達(dá)顯著高于鱗癌（P=0.014、P=0.001）（圖2、3）。

圖2 男，82歲，左上肺鱗癌。A 為肺癌病灶組織的p-AKT免疫組化染色圖，免疫組化分?jǐn)?shù)為1 分（×400）；B 為肺癌病灶組織的mTOR 免疫組化染色圖，免疫組化分?jǐn)?shù)為2 分（×400）

圖3 不同病理亞型肺癌組織p-AKT 及mTOR 表達(dá)

2.3 不同病理亞型肺癌定量灌注直方圖參數(shù)與p-AKT、mTOR 的相關(guān)性 Spearman 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，小細(xì)胞癌組Kep（Q5、Q10）與p-AKT表達(dá)呈正相關(guān)（ρ=0.841，P=0.036），Kep（能量）與p-AKT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（ρ=-0.841，P=0.036）；鱗癌組Ktrans（Q5）（ρ=0.760，P=0.001）和小細(xì)胞癌組Vp（均值、Q75、Q90、Q95）（ρ=0.926，P=0.008）與mTOR 呈正相關(guān)；鱗癌組Ve（均值）與mTOR 呈負(fù)相關(guān)（ρ=-0.619，P=0.014）（圖4、5）。

圖4 女，63歲，病理診斷為右上肺小細(xì)胞癌。A.病灶Ktrans偽彩圖；B.病灶Vp 偽彩圖；C.Vp 直方圖（均值=0.126、偏度=1.302、峰度=2.419、均一性=0.462、能量=0.009、熵=7.042）；D.Ktrans 直方圖（均值=0.175、偏度=0.956、峰度=1.358、均一性=0.521、能量=0.008、熵=7.164）

圖5 肺癌p-AKT、mTOR 與EC 模型灌注直方圖參數(shù)Kep 能量及Ve 均值的相關(guān)性

3 討論

目前肺癌的治療方法仍以放化療及手術(shù)為主。隨著對(duì)肺癌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR 通路是肺癌治療中的重要靶點(diǎn)之一[8]。既往研究表明，AKT/mTOR 靶向藥物與臨床化療藥物聯(lián)用比單獨(dú)用藥能更有效地抑制腫瘤活性，延長肺癌患者的生存時(shí)間[9-11]。與穿刺等侵入性檢查相比，DCE-MRI 是一項(xiàng)無創(chuàng)、可重復(fù)的檢查方法，所得灌注參數(shù)Ktrans、Kep、Vp、Ve能反映腫瘤的血流灌注和血管通透性等微環(huán)境的改變[12]，有助于了解腫瘤分化及惡性程度。直方圖分析用均值、偏度、峰度、能量、熵和百分位數(shù)較好地量化了腫瘤組織微循環(huán)狀態(tài)，反映腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性[13]。

本研究中，不同病理亞型肺癌中AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)存在差異，腺癌組mTOR 與p-AKT表達(dá)顯著高于鱗癌，可能提示不同病理類型肺癌發(fā)展過程中AKT/mTOR信號(hào)通路激活不一致。Fumarola 等[14]研究發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR信號(hào)通路異常激活在肺鱗癌中比在肺腺癌中更常見。然而，Oh 等[15]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中p-AKT和mTOR 的表達(dá)較肺鱗癌更為頻繁，與本研究結(jié)果一致。導(dǎo)致不同研究結(jié)果差異的原因可能與缺乏普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)通過免疫組化評(píng)估這些蛋白的表達(dá)有關(guān)。

AKT/mTOR信號(hào)通路激活可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，還可以通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子、一氧化氮、COX-2 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管形成[16]。Kep是對(duì)比劑從血管外細(xì)胞外間隙回流到血管內(nèi)的通過率，與血管壁通透性密切相關(guān)。本研究中鱗癌組Kep（Q5）、小細(xì)胞癌組Kep（Q5、Q10）隨著活化的p-AKT和mTOR 增多而增大，提示此信號(hào)通路的激活促進(jìn)新生血管形成，血管壁滲透性增加。然而Kep均值與p-AKT、mTOR 無明顯相關(guān)，其可能原因是肺癌在發(fā)展過程中血供的復(fù)雜性及其生長不均勻性較正常組織高，使得百分位數(shù)等反映參數(shù)分布特征的變量較反映參數(shù)集中趨勢的平均值更有助于反映腫瘤的異質(zhì)性[17]。能量與熵值體現(xiàn)像素分布的均勻性，能量越小，熵值越大，圖像亮度信息分布越不均勻[18]。小細(xì)胞癌組Kep（能量）與p-AKT 呈負(fù)相關(guān)，提示p-AKT表達(dá)增加促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性增高，表現(xiàn)為Kep（能量）減小。

Vp可反映組織的血流灌注量，小細(xì)胞癌組Vp（均值、Q75、Q90、Q95）與mTOR 呈正相關(guān)，提示此信號(hào)通路下游信號(hào)分子的激活刺激了腫瘤的增殖與血管形成。以Vp（Q75、Q90、Q95）為代表的高百分位數(shù)與mTOR 呈正相關(guān)，而低百分位數(shù)無明顯相關(guān)，可能原因是小細(xì)胞癌增殖速度快，易多發(fā)小片壞死，未壞死部分血供豐富，Vp值較大。Ve與血管外細(xì)胞外間隙大小有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，鱗癌組Ve（均值）與mTOR呈負(fù)相關(guān)，激活的mTOR 越多，腫瘤增殖越活躍，血管外細(xì)胞外間質(zhì)空間愈發(fā)減小，則Ve值越小。

本研究的局限性：①樣本量較小，特別是小細(xì)胞癌，有待今后擴(kuò)大樣本量和細(xì)化研究方案；②僅勾畫了部分腫瘤最大層面作為ROI，可能在描述腫瘤空間異質(zhì)性方面存在一些偏倚；③肺部進(jìn)行DCEMRI 掃描呼吸運(yùn)動(dòng)偽影較為常見。然而，本研究使用三維非剛性校正技術(shù)減少運(yùn)動(dòng)偽影對(duì)研究的影響。

總之，DCE-MRI定量灌注參數(shù)直方圖參數(shù)Kep（Q5、Q10、能量）、Ktrans（Q5）、Vp（均值、Q75、Q90、Q95）和Ve（均值）與肺癌p-AKT、mTOR 蛋白表達(dá)具有相關(guān)性，能間接評(píng)價(jià)肺癌組織AKT/mTOR信號(hào)通路基因激活狀態(tài)，具有無創(chuàng)、客觀、可量化、可重復(fù)性好的優(yōu)勢，對(duì)肺癌的診斷和AKT/mTOR 靶向藥物的選擇等有一定的指導(dǎo)意義。