紀(jì)冰 馬學(xué)工 李斌業(yè) 呂金春 李曉娜

青海省人民醫(yī)院生殖中心（西寧810007）

時(shí)差成像（time-lapse，TL）技術(shù)是一種新型胚胎培養(yǎng)與胚胎實(shí)時(shí)觀察技術(shù)。與需要將胚胎反復(fù)取出培養(yǎng)箱且只能在特定時(shí)間點(diǎn)靜態(tài)觀察胚胎的常規(guī)培養(yǎng)相比，TL培養(yǎng)系統(tǒng)既能保證足夠穩(wěn)定的胚胎培養(yǎng)環(huán)境，又能提供全面的胚胎發(fā)育動(dòng)態(tài)信息，有利于改善胚胎質(zhì)量，并能選擇出更具發(fā)育潛能的胚胎，提高IVF妊娠結(jié)局［1-3］。但也有學(xué)者認(rèn)為，TL培養(yǎng)箱中的高頻率曝光拍攝環(huán)境或存在的電磁場可能對胚胎發(fā)育及其子代有害［4］。近年來針對TL安全性的研究大多局限于其對胚胎質(zhì)量及妊娠率的影響，而有關(guān)應(yīng)用該技術(shù)出生子代情況的研究較匱乏。因此，本文就接受IVF/ICSI助孕的1 999周期資料進(jìn)行回顧性分析，比較兩種培養(yǎng)方法行卵裂期胚胎移植后的妊娠結(jié)局及新生兒情況，進(jìn)而探討與評估TL技術(shù)的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料2016年1月至2019年3月在青海省人民醫(yī)院生殖中心行IVF-ET/ICSI-ET助孕的病例共1 999周期，隨機(jī)分配患者胚胎的培養(yǎng)方式，其中TL培養(yǎng)組871周期，常規(guī)培養(yǎng)組1 128周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方年齡40歲；（2）D3卵裂期胚胎移植；（3）排除子宮畸形、子宮肌瘤、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等預(yù)后不良的患者；（4）IVF/ICSI周期數(shù)2周期。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養(yǎng)方法根據(jù)患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌、卵巢儲備等情況按照我中心常規(guī)進(jìn)行超促排卵，當(dāng)1 ～2枚卵泡直徑18 mm時(shí)注射HCG 5 000 ～10 000 IU，36 ～38 h陰道B超引導(dǎo)下行取卵術(shù)，所獲卵母細(xì)胞IVF或ICSI受精。授精后18 ～20 h，常規(guī)培養(yǎng)組將放入受精卵的微滴培養(yǎng)皿置于AD-3 100培養(yǎng)箱（6%CO2，5%O2，37 ℃）培養(yǎng)，在授精后44 h和68 h左右觀察胚胎；TL培養(yǎng)組將放入受精卵的Culture Coin專用培養(yǎng)皿置于ESCO（6% CO2，5%O2，37 ℃）培養(yǎng)箱培養(yǎng)，拍攝間隔設(shè)置為5 min［5］。每日評估胚胎發(fā)育情況，第3天選擇1 ～3枚評分最高的胚胎。

1.2.2 胚胎質(zhì)量評估常規(guī)組與TL組均參考Istanbul共識，根據(jù)卵裂球數(shù)目、碎片及卵裂球均一性等胚胎形態(tài)學(xué)方法評分［6］。TL組將卵子加入精液微滴或?qū)⒕幼⑷肼炎拥臅r(shí)間設(shè)置為時(shí)間起點(diǎn)0，標(biāo)注胚胎發(fā)育時(shí)間參數(shù)，包括原核消失時(shí)間（PNF）、胚胎發(fā)育至2、3、4、5細(xì)胞的時(shí)間（t2、t3、t4、t5）、2細(xì)胞發(fā)育至3細(xì)胞的時(shí)間（cc2）、3細(xì)胞發(fā)育至4細(xì)胞的時(shí)間（s2）；記錄胚胎卵裂模式，包括正常卵裂和異常卵裂（非二倍卵裂、發(fā)育阻滯、非對稱卵裂、卵裂球融合等）。

1.2.3 胚胎移植的選擇第3天常規(guī)組選擇1 ～3枚評分最高的胚胎移植；TL組移植胚胎篩選范圍為：形態(tài)學(xué)評分最高且卵裂模式為正常卵裂、非軸性或不均卵裂，時(shí)間參數(shù)符合t5 54.95 h和cc2 12.17 h，如無符合上述篩選條件的胚胎，則不納入研究范圍，移植后常規(guī)黃體支持。

1.2.4 妊娠結(jié)局判斷及隨訪移植后14 d測血和尿HCG，28 d B超檢查若見孕囊及胎心，則視為臨床妊娠。對臨床妊娠患者進(jìn)行定期隨訪至新生兒出生。

1.3 觀察指標(biāo)觀察兩組妊娠及新生兒結(jié)局的各項(xiàng)指標(biāo)。活產(chǎn)率：分娩活胎周期/移植周期；抱嬰回家率：至少有1例新生兒存活并抱回家的周期/移植周期；不良新生兒結(jié)局：32周前的早產(chǎn)或轉(zhuǎn)院新生兒或無抱嬰回家；低體質(zhì)量兒：出生體質(zhì)量＜2 500 g；超低體質(zhì)量兒：出生體質(zhì)量＜1 500 g；巨大兒：出生體重＞4 000 g。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料TL組與常規(guī)組的女方年齡、不孕年限、女方體質(zhì)指數(shù)（BMI）、不孕類型、不孕因素、助孕方式差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基本資料比較Tab.1 Comparison of basic data between the two groups例（%）

2.2 兩組妊娠結(jié)局比較兩組移植日內(nèi)膜、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率、多胎率之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。TL組的移植胚胎數(shù)明顯少于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。TL組的臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率及抱嬰回家率明顯高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

2.3 兩組新生兒情況比較TL組雙胎112例，共出生224例新生兒；單胎258例，出生258例新生兒。常規(guī)組雙胎108例，共出生216例新生兒；單胎300例，出生300例新生兒。兩組的早產(chǎn)率、不良新生兒結(jié)局、低體質(zhì)量兒、極低體質(zhì)量兒、巨大兒、分娩孕周、新生兒體重、畸形率及男女性別比之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表3。

3 討論

TL培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于臨床以來，其有效性和安全性一直備受關(guān)注，是輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［7-9］。

表2 兩組妊娠結(jié)局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes between the two groups 例（%）

表3 兩組新生兒情況比較Tab.3 Comparison of newborn between the two groups

3.1 TL對IVF妊娠結(jié)局的影響PRIBENSZKY等［3］的一項(xiàng)隨機(jī)對照研究表明，與常規(guī)培養(yǎng)相比，TL培養(yǎng)可顯著提高臨床妊娠率（51.0% vs. 39.9%，P ＜0.05），顯著降低早期流產(chǎn)率（15.3% vs. 21.3%，P ＜0.05）和顯著增加活產(chǎn)率（44.2%vs.31.3%，P ＜0.05）。KALLEAS等［10］的研究顯示，與使用常規(guī)培養(yǎng)的患者相比，使用TL培養(yǎng)的患者的活產(chǎn)率顯著升高，早期流產(chǎn)率顯著降低。本研究中，TL組的平均移植胚胎數(shù)明顯低于常規(guī)組（P ＜0.05），但妊娠率、著床率、活產(chǎn)率及抱嬰回家率明顯高于常規(guī)組（P ＜0.05），說明經(jīng)TL培養(yǎng)及篩選出的胚胎具有更好的發(fā)育潛能，能明顯改善IVF妊娠結(jié)局，提示TL可作為卵裂期單胚胎移植的篩選方法。較高的流產(chǎn)率是輔助生殖技術(shù)無法規(guī)避的難題，也極大地?fù)p害了患者身心健康，早期流產(chǎn)主要與胚胎質(zhì)量尤其是胚胎染色體異常有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與常規(guī)組相比，TL組的早期流產(chǎn)率并未降低（P ＞0.05）。染色體異常的胚胎可能會出現(xiàn)異常分裂現(xiàn)象，如非二倍卵裂、卵裂球融合、胚胎多核現(xiàn)象等［11-12］。本研究TL組選擇移植胚胎時(shí)已將此類胚胎進(jìn)行排除，但移植后的早期流產(chǎn)率仍居高不下，可能是本中心目前對TL提供的胚胎發(fā)育信息的研究尚不夠全面，部分染色體異常的胚胎無法用相關(guān)的胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)甄別所致。由此可見，為了盡可能降低早期胚胎丟失，將其轉(zhuǎn)化為活產(chǎn)，應(yīng)充分明確胚胎發(fā)育中各參數(shù)的意義，為胚胎選擇提供參考。

3.2 TL 對新生兒的影響隨著TL應(yīng)用的普及，通過該技術(shù)培養(yǎng)及選擇胚胎移植的新生兒出生情況是輔助生殖工作者日益關(guān)注的問題。2017年INSUA等［13］首次報(bào)道了針對時(shí)差監(jiān)測系統(tǒng)對新生兒結(jié)局的隨機(jī)研究，分析216例TL培養(yǎng)與162例傳統(tǒng)培養(yǎng)的單胎妊娠產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局，發(fā)現(xiàn)兩組的新生兒出生體重、低體重兒比例、極低體重兒比例及早產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示，TL組單胎妊娠及雙胎妊娠圍生期結(jié)局的各項(xiàng)指標(biāo)均與常規(guī)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在結(jié)果中并未觀察到有害的圍產(chǎn)期結(jié)局，這也就說明了TL胚胎培養(yǎng)方式和培養(yǎng)環(huán)境并未對胎兒在宮內(nèi)的生長發(fā)育及新生兒的產(chǎn)科結(jié)局產(chǎn)生不利影響。但MASCARENHA等［14］研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)培養(yǎng)相比，TL培養(yǎng)可改善IVF的圍生結(jié)局，主要表現(xiàn)為較低的早產(chǎn)率和更高的新生兒平均出生體重，與本次研究結(jié)果不同，這可能是由于數(shù)據(jù)樣本量以及其他因素不同造成的，這就需要后期收集更多的樣本量并且統(tǒng)一數(shù)據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)等來進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。眾所周知，雙胎妊娠是IVF的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，會顯著增加母兒的不良圍產(chǎn)期及產(chǎn)科結(jié)局［15-17］，因此充分利用TL提供的胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)建立合理有效的胚胎篩選模式，減少移植胚胎數(shù)目，降低多胎風(fēng)險(xiǎn)，保證IVF母嬰安全與健康。

自然妊娠狀態(tài)下男女嬰兒的出生比例為106～110.2∶100［18］，有研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)周期行卵裂期胚胎移植并不會加大新生兒性別比［19-20］，本研究中常規(guī)組性別比為110∶100，與報(bào)道相接近，但TL組的性別比高達(dá)130∶100，雖然在此次研究中，兩組的新生兒性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但較常規(guī)組有升高趨勢。TL組選擇移植胚胎不僅考慮胚胎形態(tài)，還需參考胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)，而胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)又因各中心患者情況、培養(yǎng)條件、人員操作等因素影響各不相同［21-22］，尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此TL組性別比偏高可能與本研究根據(jù)TL提供的胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)而建立的胚胎篩選模式存在潛在的性別偏差或樣本量太少有關(guān)，具體原因尚需多中心、大樣本的研究。

綜上所述，TL培養(yǎng)對IVF的妊娠圍產(chǎn)結(jié)局并無不良影響，是進(jìn)行胚胎培養(yǎng)的有效和安全方法。但目前TL技術(shù)在臨床的應(yīng)用時(shí)間較短，尚無法確定其對出生子代的遠(yuǎn)期健康風(fēng)險(xiǎn)，這也是本研究的不足之處及需要后期進(jìn)一步探索的方向，因此今后需建立更加長期完善的隨訪制度，觀察子代健康狀況，以便對TL技術(shù)的安全性做出更全面的評估。