吳雪芳 李霜 楊迎春 涂貴蘭 龍訓(xùn) 龍艷麗 陳祎 易韋

貴州省人民醫(yī)院病理科（貴陽(yáng)550002）

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)生率呈逐年增高趨勢(shì)，雖化療藥物和化療方案不斷更新，但部分患者預(yù)后仍未得到明顯改善。目前研究顯示腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用，且是腫瘤化療耐藥、復(fù)發(fā)的根源［1］。DCAMKL-1是近來發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞的一種新型標(biāo)志物，在多種腫瘤中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)DCAMKL-1可表達(dá)于結(jié)直腸癌干細(xì)胞［2］，這類細(xì)胞具有高度的自我更新和增殖能力，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和耐藥的產(chǎn)生。TP53基因作為一種非常經(jīng)典和重要的抑癌基因在結(jié)直腸癌中經(jīng)常發(fā)生突變，可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生并參與耐藥［3-4］，已得到廣泛認(rèn)可。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)DCAMKL-1和p53蛋白在癌旁正常黏膜（adjacent normal mucosa，ANM）、CRC組織中的表達(dá)，初步探討兩者與臨床病理特征的關(guān)系，以及與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集貴州省人民醫(yī)院2014年12月至2019年4月間手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的126例結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)放化療及生物治療，男78例，女48例，年齡24～89歲，中位年齡57歲。所有標(biāo)本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師分別診斷并進(jìn)行腫瘤分化程度評(píng)估，其中包括高分化19例，中分化79例，低分化28例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第七版指南進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期53例，Ⅳ期35例。

1.2 免疫組織化學(xué)按免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說明書步驟進(jìn)行，DCAMKL-1、p53抗體孵育前均經(jīng)抗原高壓熱修復(fù)，用已知陽(yáng)性表達(dá)的癌組織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作空白對(duì)照。所用抗體包括濃縮型兔抗人DCAMKL-1多克隆抗體（克隆號(hào)ab31704，美國(guó)Abcam公司，稀釋濃度1∶100），濃縮型鼠抗人p53單克隆抗體（克隆號(hào)DO-7，北京中杉金橋生物有限公司，稀釋濃度1∶100），SP染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 結(jié)果判讀所有病理切片均由資深病理診斷醫(yī)師判讀。DCAMKL-1結(jié)果判讀參照GAO等［5］的方法，DCAMKL-1蛋白的表達(dá)主要定位在細(xì)胞漿，評(píng)價(jià)綜合2個(gè)獨(dú)立的評(píng)分因素，染色面積0（＜5%）、1（5%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）和4（＞75%），染色強(qiáng)度（0=沒有，1=輕微，2=溫和，3=強(qiáng)）。將兩種評(píng)分相乘，得到0、1、2、3、4、6、8、9、12分，當(dāng)其值4時(shí)DCAMKL-1的免疫染色被認(rèn)為是陽(yáng)性表達(dá)；值為0～3時(shí)，免疫染色被認(rèn)為是陰性表達(dá)。p53蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，以胞核中有棕褐色顆粒染色為陽(yáng)性，結(jié)果判讀參照OH等［6］和RACHMAWATI等［7］的方法，以陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)50%為強(qiáng)陽(yáng)性，＜50%為弱陽(yáng)性，0為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)比較不同組間表達(dá)率的差異，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法、Log-rank檢驗(yàn)及多因素Cox回歸分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCAMKL-1 和p53 蛋白在ANM 及CRC 組織中的表達(dá)情況DCAMKL-1在ANM組織中呈陰性表達(dá)，在CRC組織中陽(yáng)性率為71.4%（90/126），主要定位于腫瘤細(xì)胞漿，呈顯著的增高趨勢(shì)（P ＜0.05）。p53定位于腫瘤細(xì)胞核，在ANM和CRC組織中陰性、弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率分別為92.1%（116/126）、7.9%（10/126）、0（0/126）和25.4%（32/126）、14.3%（18/126）、60.3%（76/126），CRC組織p53的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于ANM（P ＜0.05）。見表1和圖1、2。

表1 DCAMKL-1 和p53 蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)Tab.1 Expressions of DCAMKL-1 and p53 proteins in Colorectal tissue 例

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DCAMKL-1 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)（SP，×100）Fig.1 The expressions of DCAMKL-1 protein in CRC and ANM were detected by immunohistochemistry（SP，×100）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)p53 蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)（SP，×200）Fig.2 The expressions of p53 protein in CRC and ANM were detected by immunohistochemistry（SP，×200）

2.2 DCAMKL-1 及p53 蛋白的表達(dá)與CRC 患 者臨床病理特征的關(guān)系DCAMKL-1在CRC患者年齡、性別、臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。p53在CRC患者年齡、性別、腫瘤分化程度上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），而p53的表達(dá)在腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.048、0.007）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中DCAMKL-1 和p53 蛋白的表達(dá)Tab.2 Expressions of DCAMKL-1 and p53 proteins in colorectal carcinoma tissues 例

2.3 DCAMKL-1、p53 蛋白的表達(dá)與CRC 患者生存預(yù)后的關(guān)系隨訪截至2019年9月，有隨訪資料96例，隨訪率76.2%，隨訪時(shí)間6～53個(gè)月，死亡14例（14.6%），存活82例（85.4%），Kaplan-Meier生存分析顯示1年生存率93.6%，2年生存率85.5%，3年生存率83.9%。對(duì)性別、年齡（分為＞65歲組與65歲組）、腫瘤分化程度（分為高分化組、中分化組與低分化組）、臨床分期（分為Ⅰ+Ⅱ組與Ⅲ+Ⅳ組）及DCAMKL-1表達(dá)（分為陰性組與陽(yáng)性組），p53（分為弱陽(yáng)性組、陰性/強(qiáng)陽(yáng)性組）蛋白表達(dá)情況分別進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期與預(yù)后明顯相關(guān)，Ⅰ+Ⅱ期的患者預(yù)后明顯好于Ⅲ+Ⅳ期的患者，且兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004，3年總體生存率：100%vs.75.3%）；腫瘤分化程度總生存率差異雖然不明顯，但高分化組生存率高于中、低分化組。DCAMKL-1與p53蛋白的表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后無影響（P ＞0.05）。將年齡、性別、腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、DCAMKL-1和p53蛋白表達(dá)情況引入Cox模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，臨床分期是影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素（HR = 6.364，P =0.001）。見圖3和表3。

圖3 結(jié)直腸癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier curves of patients with colorectal carcinoma

表3 CRC 患者多因素COX 回歸分析Tab.3 Multivariate COX regression analysis of CRC patients

3 討論

DCAMKL-1基因位于第13號(hào)染色體長(zhǎng)臂（13q13），是在有絲分裂后的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的一種跨膜微管相關(guān)蛋白激酶，近年學(xué)者們發(fā)現(xiàn)它是一種特異性的胃腸道腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）標(biāo)志物，存在于多種實(shí)體腫瘤中，包括胰腺、前列腺、結(jié)腸和肝細(xì)胞癌等［2］。MAY等［8］研究發(fā)現(xiàn)將DCAMKL-1陽(yáng)性細(xì)胞注射到裸鼠，能夠形成腺樣結(jié)構(gòu)和所有腸細(xì)胞系，這說明DCAMKL-1陽(yáng)性細(xì)胞具有多能性，進(jìn)一步有力地證明了DCAMKL-1陽(yáng)性細(xì)胞可能為干細(xì)胞。NAKANISHI等［2］發(fā)現(xiàn)患有大腸癌的實(shí)驗(yàn)鼠，含有DCAMKL-1蛋白的細(xì)胞會(huì)在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞，通過基因操作，有選擇地清除含這種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)的大腸癌組織面積縮小了80%以上，有些甚至完全消失，而且未發(fā)現(xiàn)副作用，以此標(biāo)志為目標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞的精準(zhǔn)攻擊，有望用來研發(fā)幾乎沒有副作用的抗癌藥物。SHI等［9］分析發(fā)現(xiàn)DCAMKL-1可能是惡性腫瘤發(fā)展的危險(xiǎn)因素，并可能成為惡性腫瘤的有前景的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示CRC組織中DCAMKL-1蛋白表達(dá)較ANM顯著增高，從組織學(xué)層面證明了DCAMKL-1蛋白的表達(dá)與CRC的發(fā)生密切相關(guān)，提示DCAMKL-1蛋白的檢測(cè)對(duì)CRC的早期診斷可能有一定的幫助。

人野生型TP53基因編碼一種核蛋白，它是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，該蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、細(xì)胞衰老和分化，以響應(yīng)內(nèi)源性和外源性應(yīng)激信號(hào)，可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來應(yīng)對(duì)癌基因信號(hào)激活以及DNA損傷等不利因素［10］。由于野生型p53蛋白半衰期短，細(xì)胞內(nèi)含量低，因此難以檢測(cè)到［11］。但當(dāng)TP53基因突變后，其編碼的p53蛋白半衰期較長(zhǎng)，穩(wěn)定性強(qiáng)，在核內(nèi)不斷積累，失去了對(duì)細(xì)胞的監(jiān)視作用，從而在細(xì)胞惡變中起著癌基因的作用［12］。TP53基因是一種非常經(jīng)典和重要的抑癌基因，在多種腫瘤中發(fā)生突變，結(jié)直腸癌TP53基因突變常見［13］。XI等［14］研究顯示，正常結(jié)直腸黏膜上皮p53表達(dá)陰性，隨著腸腺上皮不典型增生的出現(xiàn)p53陽(yáng)性表達(dá)隨之增高，且在CRC中表達(dá)最高，表明p53表達(dá)上調(diào)在結(jié)直腸正常黏膜經(jīng)腺瘤向癌發(fā)展過程中起著重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)在ANM中p53絕大部分均為陰性，CRC組織中p53陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于ANM，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15-16］。因此，檢測(cè)p53表達(dá)情況有利于預(yù)測(cè)早期癌變的發(fā)生及臨床早期診斷。既往大量研究認(rèn)為在大多數(shù)腫瘤中TP53發(fā)生突變，免疫組化p53蛋白是高表達(dá)的，因此學(xué)者們?cè)谘芯縫53蛋白在CRC組織表達(dá)情況時(shí)多采用2層分組方式（陰性/陽(yáng)性）。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)TP53基因的深入研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)CRC組織免疫組化p53蛋白表達(dá)陰性時(shí)，大多數(shù)腫瘤也出現(xiàn)了p53基因的突變，主要表現(xiàn)為無義突變或移碼突變，提示采用2層分組方式有一定的缺陷性。OH等［6］學(xué)者為了探討p53蛋白表達(dá)與TP53遺傳狀態(tài)的關(guān)系，將p53免疫組化結(jié)果與靶向外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在CRC患者p53陰性表達(dá)組中53%發(fā)生錯(cuò)義突變或無義突變，在p53高表達(dá)組（50%腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性），約80%發(fā)生錯(cuò)義突變，而p53低表達(dá)組（＜50%腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性），超過70%的CRC患者沒有發(fā)生TP53基因突變，這說明p53低表達(dá)組的CRC更有可能代表野生型TP53的CRC。因此本研究將p53表達(dá)分為陰性組、弱陽(yáng)性組（＜50%腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性）、強(qiáng)陽(yáng)性組（50%腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性），進(jìn)一步將這3組分為野生型組（弱陽(yáng)性組）、突變型組（陰性/強(qiáng)陽(yáng)性組）。雖然按p53免疫反應(yīng)程度來評(píng)估TP53基因狀態(tài)具有異質(zhì)性及局限性，但參考OH等［6］及LOGULLO等［17］報(bào)道的p53表達(dá)與TP53基因型狀態(tài)具有顯著相關(guān)性，提示這種分組方式具有較好的可行性，且本研究最初也采用了2層分組方式（陰性組/陽(yáng)性組），未發(fā)現(xiàn)p53與病理臨床特征的關(guān)系，而采用3層分組方式（陰性組/弱陽(yáng)性組/強(qiáng)陽(yáng)性組）時(shí)，發(fā)現(xiàn)p53突變型組（陰性/強(qiáng)陽(yáng)性）與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p53蛋白處于突變型表達(dá)模式（陰性/強(qiáng)陽(yáng)性）時(shí)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［18-19］。綜合分析本研究認(rèn)為采用3層分組方式優(yōu)于2層分組，且這種3層分組方式可以較好的運(yùn)用于臨床病理診斷判讀中，有助于預(yù)估臨床分期和患者預(yù)后情況。

本研究對(duì)96例CRC患者的隨訪結(jié)果進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期Ⅲ+Ⅳ組生存率曲線低于Ⅰ+Ⅱ組，提示臨床分期是影響CRC患者生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度高分化組的生存率高于中、低分化組。文獻(xiàn)報(bào)道DCAMKL-1蛋白與CRC患者預(yù)后相關(guān)［20］，本研究暫未發(fā)現(xiàn)該相關(guān)性，可能是因本研究樣本量較少、納入對(duì)象種群不同等多種因素影響，可增加樣本量進(jìn)一步分析探討。OH等［6］報(bào)道在輔助化療的Ⅲ期和高危Ⅱ期CRC患者中，p53表達(dá)狀態(tài)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物。本研究未發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)對(duì)CRC患者生存時(shí)間有影響，這可能是由納入研究的對(duì)象臨床分期等因素不同引起。進(jìn)一步的多因素分析顯示，臨床分期是影響CRC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，提示對(duì)CRC患者的預(yù)后評(píng)估具有較高的價(jià)值。

本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CRC、ANM組織中DCAMKL-1、p53的表達(dá)，結(jié)果表明CRC組DCAMKL-1、p53明 顯 高 表 達(dá) 于ANM組，推 測(cè)DCAMKL-1、p53在CRC的發(fā)生中起到一定調(diào)控作用。p53與CRC的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且臨床分期是影響CRC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。