黃杏玲 鄧新娥 王遠(yuǎn)流 陳惠 劉百靈

柳州市婦幼保健院（廣西柳州545001）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是最常見的出生缺陷，在活產(chǎn)新生兒中占0.8% ～1.3%，是全世界嬰兒發(fā)病和死亡的最大病因，也是全球經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要來源［1］。染色體異常、單基因病、環(huán)境致畸、母體暴露和感染因子都被認(rèn)為是CHD的潛在病因，約20%的CHD在產(chǎn)前被診斷為染色體異常［2］。隨著外科技術(shù)、介入技術(shù)和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，出生后的CHD患者的預(yù)期壽命在過去幾十年里顯著提高，并可獲得正常的心臟功能［3］，但染色體異常綜合征型的CHD，嚴(yán)重的心外結(jié)構(gòu)異常和/或產(chǎn)后神經(jīng)發(fā)育障礙會(huì)導(dǎo)致CHD胎兒預(yù)后不良。因此強(qiáng)烈建議對(duì)胎兒CHD的染色體異常進(jìn)行產(chǎn)前診斷。在過去的臨床實(shí)踐中，染色體核型分析是檢測(cè)CHD胎兒染色體異常的主要方法。然而，核型分型是費(fèi)時(shí)的，分辨率低，并不能滿足目前臨床檢測(cè)的需要。二代測(cè)序技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的以高通量、低成本、速度快為主要特征的技術(shù)，能在一次檢測(cè)中分析整個(gè)基因組范圍的CNV及其所影響的基因，并為疾病基因的發(fā)現(xiàn)及基因型-表型關(guān)聯(lián)分析提供強(qiáng)有力的工具［4］。因此，本文通過應(yīng)用染色體核型分析及低深度拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNVSeq）技術(shù)兩種方法，同時(shí)對(duì)CHD胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，判斷是否存在染色體遺傳綜合征，在孕期通過早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預(yù)，可最大程度減少綜合征型CHD患兒的出生；通過分析不同類型CHD的染色體畸變檢出情況，探討不同類型CHD與染色體畸變的關(guān)系，評(píng)估CNV-seq在胎兒CHD的應(yīng)用價(jià)值，為臨床咨詢及評(píng)估胎兒預(yù)后提供可靠依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象以2017年1月至2019年5月在柳州市婦幼保健院進(jìn)行超聲頸項(xiàng)透明層的檢查和/或系統(tǒng)彩超或針對(duì)胎兒超聲心動(dòng)圖檢查等，被產(chǎn)前超聲診斷為胎兒心臟異常伴或不伴心外異常的孕婦為研究對(duì)象。本研究已通過醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審查。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)兩名具有產(chǎn)前超聲診斷資質(zhì)的醫(yī)師診斷胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常伴或不伴心外異常的孕婦；（2）經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢并知情同意行介入性產(chǎn)前診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有介入性產(chǎn)前診斷禁忌或拒絕產(chǎn)前診斷的孕婦；（2）心臟表型只涉及心律失?；蛐陌e液的胎兒或重度地貧的胎兒。最終納入研究病例共有181例，181例按是否伴有心外結(jié)構(gòu)異常分為獨(dú)立型CHD組146例和伴有心外異常CHD組35例，按心臟缺陷的類型分為9類，見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 介入性產(chǎn)前診斷所有孕婦均進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢，并被充分告知相關(guān)產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷的必要性、局限性及風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)孕婦知情同意及簽署知情同意書后根據(jù)孕婦就診孕周不同采用不同的介入性穿刺術(shù)，所有介入性操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)前診斷管理辦法中的介入性產(chǎn)前診斷穿刺術(shù)常規(guī)進(jìn)行。

1.2.2 染色體核型分析所獲取的羊水和臍血進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，以G顯帶染色（必要時(shí)加做C顯帶或N顯帶）制備染色體標(biāo)本，每例標(biāo)本按照ISCN（2016）標(biāo)準(zhǔn)，油鏡下分析20個(gè)分散好、中等長(zhǎng)度的中期分裂相，發(fā)現(xiàn)嵌合體或異常核型時(shí)加數(shù)到100個(gè)分裂相。

1.2.3 CNV-Seq 技術(shù)分析（1）提取基因組DNA；（2）DNA文庫(kù)構(gòu)建；（3）上機(jī)測(cè)序；（4）生物信息學(xué)分析；然后通過檢索UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUBMED等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CNV臨床意義的確定。

1.2.4 隨訪對(duì)所有病例均進(jìn)行電話隨訪妊娠結(jié)局及新生兒情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料處理，采用卡方χ2檢驗(yàn)（Fisher′s檢驗(yàn)）對(duì)組間染色體畸變檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲檢查結(jié)果181例胎兒CHD按心臟缺陷的類型分為9類：其中最常見的為室間隔缺損，占所有病例的33.1%；其次為圓錐動(dòng)脈干畸形（conotruncal defects，CTD）占10.5%。按是否伴有心外結(jié)構(gòu)異常分為獨(dú)立型CHD組（146/181，80.7%）和伴有心外異常CHD組（35/181，19.3%），見表1、2。

2.2 181例胎兒染色體畸變結(jié)果染色體核型分析檢出染色體畸變共有20例（20/181，11.0%），包括15例染色體非整倍體（以21-三體、18-三體為主），1例嵌合體，4例結(jié)構(gòu)異常。CNV-Seq分析檢出43例（43/181，23.8%）CNVs，其中28例（28/181，15.5%）為致病性CNVs（含20例與染色體核型分析一致的染色體異常和8例亞顯微結(jié)構(gòu)異常的致病性CNVs）；7例（7/181，3.9%）臨床意義不明的變異（various of unknown significance，VOUS）；CNV-Seq分析比傳統(tǒng)染色體核型分析額外檢出了8.4%的染色體畸變。

2.3 不同類型CHD染色體畸變情況獨(dú)立型CHD組染色體畸變檢出率為9.6%（14/146），伴心外異常CHD組檢出13例（13/35，37.1%）染色體核型異常和1例亞顯微結(jié)構(gòu)異常。伴心外異常CHD組的染色體畸變檢出率顯著高于獨(dú)立型CHD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（40.0%vs.9.6%，P ＜0.05），見表2。

表1 胎兒先天性心臟病表型分類Tab.1 Classification of fetal congenital heart disease phenotypes

表2 不同類型CHD 胎兒的染色體畸形檢出結(jié)果Tab.2 Chromosomal malformation detection results of different types of CHD fetuses 例（%）

2.4 妊娠結(jié)局的隨訪181例孕婦均接受電話隨訪，分娩活產(chǎn)兒117例（64.6%，117/181），優(yōu)生引產(chǎn)62例，死胎引產(chǎn)2例。64例引產(chǎn)胎兒中，主要包括遺傳綜合型CHD和復(fù)雜CHD胎兒；117例活產(chǎn)嬰兒中，5例發(fā)現(xiàn)伴有心外結(jié)構(gòu)異常，包括尿道下裂和胸椎畸形、左手軸前多指、雙側(cè)瞳孔缺如、腭裂和下頜小、外耳畸形；1例因合并肺炎死亡；其他新生兒一般情況良好，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙等異常。

3 討論

3.1 不同類型胎兒CHD的染色體畸變分析染色體異常與CHD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，系列研究報(bào)道胎兒CHD染色體異常發(fā)生率約10%～30%［2，5-6］。吳莉等［7］報(bào)道胎兒CHD染色體核型分析異常染色體檢出率為9.7%（7/72），而通過SNP分析技術(shù)，染色體拷貝數(shù)異常的檢出率為16.7%（12/72），其中有明確臨床致病意義的為13.9%（10/72）；郭珍等［8］研究30例胎兒右位主動(dòng)脈弓染色體核型異常的發(fā)生率為10%，致病性CNV檢出率為23.3%；BENSEMLALI等［9］研究表明伴有心外畸形的CHD胎兒染色體畸變發(fā)生率為29.1%；DELEA等［10］研究報(bào)道圓錐動(dòng)脈干畸形占CHD的10% ～30%，其染色體畸變發(fā)生率為25.8%。不同研究均報(bào)道了CHD與染色體異常的密切關(guān)系，是CHD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，但是不同研究的報(bào)道染色體異常的發(fā)生率有所差異，考慮主要與納入的研究對(duì)象及分析的方法不同相關(guān)。在本研究中，納入181例胎兒CHD染色體核型分析異常發(fā)生率為11.0%（20/181），而通過CNV-seq分析，染色體拷貝數(shù)異常檢出為23.8%，其中有明確致病意義的CNV占15.5%，臨床意義不明的變異為3.9%。CNV-Seq技術(shù)比傳統(tǒng)染色體核型分析額外檢出了8.4%的染色體畸變，提高了CHD胎兒的染色體畸變檢出率，是染色體核型分析有效的補(bǔ)充檢測(cè)手段。本文還描述了不同類型CHD的染色體異常頻率和分布，不同類型的胎兒CHD染色體畸變檢出率不一樣，CHD伴心外異常組的異常檢出率顯著地高于獨(dú)立型CHD組（40.0% vs. 9.6%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），這與BENSEMLALI等［9］研究報(bào)道相似。在一些系列研究里［11-13］，與染色體異常相關(guān)的CHD最常見的是房室間隔缺損（40% ～67%），發(fā)生率最低的是完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（4%），但在本研究中，獨(dú)立型胎兒CHD中以右室流出道異常、復(fù)雜的錐干異常和孤立的瓣膜異常染色體畸變檢出率較高，分別為37.5%、37.5%和25.0%，而左室流出道異常、左室發(fā)育不良綜合征、內(nèi)臟異位綜合征的檢出率最低。原因考慮為納入的研究病例不同。另外，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶致病性CNV及VOUS胎兒中獨(dú)立型CHD組以染色體微缺失/微重復(fù)為主，2例22q11.2微缺失的胎兒都表現(xiàn)為獨(dú)立型CHD，合并心外異常組以染色體非整倍體為主。DASOUKI等［14］研究也發(fā)現(xiàn)CNVs高頻率出現(xiàn)在間隔缺損患者中，這進(jìn)一步佐證的CNV是影響心血管發(fā)育和功能通路主要原因之一，從而為CHD發(fā)病機(jī)制中的復(fù)雜致病機(jī)制的研究提供了檢測(cè)手段和切入點(diǎn)。綜上表明，本研究為進(jìn)一步了解胎兒CHD的遺傳學(xué)病因及分析胎兒CHD表型與CNV的相關(guān)性提供契機(jī)，為胎兒CHD的精準(zhǔn)遺傳咨詢和臨床診治提供可靠的依據(jù)，也為胎兒CHD的遺傳學(xué)病因積累了數(shù)據(jù)。

3.2 CNV-seq 技術(shù)在胎兒CHD 的拷貝數(shù)變異分析中的應(yīng)用拷貝數(shù)變異（copy number variantion，CNV）是神經(jīng)發(fā)育障礙和先天性畸形譜系的一個(gè)廣泛的已知原因［15-16］。CNV通常大小為1 kb（千堿基）或較大，不能用標(biāo)準(zhǔn)核型分析診斷。目前對(duì)CNV的檢測(cè)平臺(tái)主要有CMA和CNV-seq技術(shù)平臺(tái)，兩種檢測(cè)平臺(tái)均能對(duì)胎兒CHD進(jìn)行有效的檢測(cè)?；诙鷾y(cè)序技術(shù)的CNV-seq技術(shù)是近年迅速發(fā)展起來的一種以高通量、低成本、速度快為主要特征的技術(shù)。WANG等［17］研究表明：與CMA平臺(tái)相比，CNV-seq識(shí)別出了額外的且具有臨床意義的CNV，具有更高的分辨率和更高的檢測(cè)嵌合現(xiàn)象的敏感性。WANG等［18］在一項(xiàng)大型前瞻性臨床研究中也表明，CNV-seq在胎兒異常方面的產(chǎn)前診斷具有很高的可靠性和準(zhǔn)確性。2019年我國(guó)專家共識(shí)提出并推薦CNV-seq技術(shù)可作為一線產(chǎn)前診斷技術(shù)［19］。在胎兒CHD研究方面，ZHU等［20］在胎兒心臟畸形研究中運(yùn)用CMA和CNV-Seq兩種技術(shù)采用盲法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CMA與CNV-Seq對(duì)CNV的檢測(cè)敏感性和特異性相當(dāng)，同時(shí)表明了CNV-seq能額外提高CHD染色體異常的檢出率；本研究也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CNV-Seq技術(shù)在CHD胎兒中染色體畸變的檢出率為19.4%，比傳統(tǒng)染色體核型分析額外檢出了8.4%的染色體畸變，其中有明確致病意義的CNV占15.5%。前述研究說明了CNV-seq是CHD胎兒的產(chǎn)前診斷中一種更具臨床適用性檢測(cè)技術(shù)。但本研究同時(shí)檢出臨床意義不明的變異為3.9%，VOUS是CNV-seq的主要局限性之一，SHI等［21］運(yùn)用CNV-seq分析114例胎兒產(chǎn)前CNV來源和變異類型的研究表明：72.3%的胎兒CNV來自父母，27.7%是新發(fā)變異；其中父母來源的CNV胎兒結(jié)局更好。因此，對(duì)發(fā)現(xiàn)意義不明的CNV可對(duì)父母進(jìn)行CNV檢測(cè)，對(duì)咨詢更有幫助。但是，在本研究里，父母雙方因經(jīng)濟(jì)原因多數(shù)未行CNV檢測(cè)，不能追溯意義不明CNV的來源，造成咨詢困難。

3.3 胎兒CHD 的預(yù)后分析HOPKINS等［5］研究表明，與CHD相關(guān)的遺傳綜合征的產(chǎn)前診斷以及產(chǎn)科、遺傳和兒科醫(yī)師之間的密切溝通有助于優(yōu)化母嬰結(jié)局。ZIMMERMAN等［22］研究也表明在中、低收入國(guó)家也能對(duì)產(chǎn)前診斷CHD胎兒及時(shí)采取有效措施從而優(yōu)化CHD嬰兒結(jié)局。在本研究中，分娩活產(chǎn)兒117例（64.6%，117/181），終止妊娠62例，宮內(nèi)死胎2例。64例引產(chǎn)胎兒中，主要包括了遺傳綜合型CHD和復(fù)雜的CHD。117例活產(chǎn)嬰兒中，94.9%預(yù)后良好，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育障礙等其他異常。通過對(duì)胎兒CHD進(jìn)行適宜的產(chǎn)前診斷，鑒定相關(guān)的遺傳綜合征或主要的心外異常有助于了解病因，此外，它還可評(píng)估預(yù)后和再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)臨床診治，同時(shí)強(qiáng)烈影響父母選擇終止妊娠或產(chǎn)后護(hù)理的決定，幫助優(yōu)化新生兒結(jié)局。