肖軍華 賀志龍 陳冰心 高蘇俊 張永凱 許春芳

1蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科（江蘇蘇州215006）；2揚州蘇北人民醫(yī)院（江蘇揚州225001）；3上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院（上海200062）

克羅恩?。–rohn′s disease，CD）由于其致病機理未明，目前仍沒有根治方法，近年來CD在亞洲國家發(fā)病率呈上升趨勢［1］。CD常用藥物治療反應差，且難以達到黏膜緩解，并發(fā)癥多，易產生瘺管、狹窄，手術率高，術后易復發(fā)，伴隨失去工作能力的高風險?？筎NF-α單克隆抗體的應用改善了IBD的診治以及預后［2］。英孚利昔單抗（Infliximab，IFX）是一類嵌合的抗TNF抗體，是CD目前最為有效的治療措施，抗腫瘤壞死因子的使用，降低了CD的手術率以及并發(fā)癥的發(fā)生率。然而，還有一定數量的患者TNF抗體治療仍無效（有約1/3的CD患者對于IFX初治無效），而另外一些患者經過一段時間治療后演變?yōu)槔^發(fā)性無效［3］。這兩種現(xiàn)象的原因及其機制依然不明。

IFX初治無效臨床定義是經IFX誘導治療不能改善臨床癥狀和體征［4］。在最初的英夫利昔單抗治療難治性CD的“Targan”研究中，IFX初治有效被定義為4周后克羅恩病活動指數CDAI（Crohn′s disease activity index，CDAI）降 低70［5］。目前大多數臨床研究將連續(xù)兩次至少5 mg/kg英夫利昔單抗輸注后，在4周評估缺乏反應定義為初治無效［6-8］。治療無效常與血清藥物低濃度和或體內產生藥物中和抗體相關［9-11］。然而，IFX初治無效的原因在很大程度上依然是未知的，雖然目前已經提出了一些可能的機制：包括藥代動力學或藥效學方面或者兩者都有［12-13］。前者可能是由于疾病的高炎癥狀態(tài)與過量的TNF-α負荷，和/或抗腫瘤壞死因子抗體的產生。后者可能是由于非TNF-α介導的免疫炎癥性反應的機制主導。初治無效的另一種機制是抗體清除增強導致藥物濃度不足。單克隆抗體的清除受多種因素的影響，包括體重指數、性別、同時使用免疫抑制劑、血清白蛋白濃度和炎癥負荷［14-16］。近期研究表明，糞便中抗體的丟失可能代表著一個可能的機制：從“滲漏的腸道”中增加藥物清除，導致對重癥UC病人的治療效果不佳［17］。為了證實CD患者IFX初治無效是否有IFX腸道滲漏相關，本研究進行了以下實驗。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧分析了2016年9月至2019年9月期間蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化科住院的回結腸型CD患者。入選患者符合我國CD診斷指南標準［18］，包括臨床、內鏡、以及組織學表現(xiàn)。并經激素及免疫抑制劑失效；既往未使用IFX治療；病變部位位于回結腸的CD患者。排除標準：年齡在16歲以下、70歲以上；肝、腎功能不全，心功能不全；妊娠期；碘過敏患者；既往使用過抗腫瘤壞死因子α治療的患者。入選后，所有患者應用5 mg/kg IFX靜脈注射治療。同時收集入選患者5個時間點的糞便，分別為第1、4、7、10、14天。收集入選患者臨床基線參數：包括CDAI、內鏡下評分SES-CD（3為緩解，4 ～10輕度，11 ～19中度，20為重度），以及臨床實驗室指標（HB，白蛋白，CRP、ESR）。應用CDAI評估臨床活動：其中CDAI 150，認為CD患者疾病處于緩解期、CDAI＞150，應為CD患者疾病處于活動期，并結合臨床資料進行生化檢測（包括ESR，CRP，全血細胞計數，和纖維蛋白原）以及血清IFX濃度（第2周），以及腸鏡（入選時及第8周）。所有入選患者均告知其相關信息及權益，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法糞便處理：收集的糞便樣本用含6%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液1∶5稀釋后，渦旋60 min，3 000 g離心5 min，取上清存儲在-20 ℃冰箱。利用ELISA試劑盒（Sanquin Biologicals Laboratory，Amsterdam，The Netherlands）測定IFX第二周血清濃度以及糞便濃度濃度。在第2月及3月評估患者臨床及內鏡反應。

1.3 判定標準臨床有效定義為：CDAI下降＞70。內鏡有效定義為：SES-CD 3。入選患者32例（男18例，年齡中位數48歲，范圍16 ～61歲，病程中位數39個月，范圍7 ～29個月）。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 20.0進行數據分析。所有連續(xù)變量均用表示。兩組間的IFX血清及糞便濃度組間差異應用t檢驗進行分析，當非正態(tài)分布時，采用t′檢驗，IFX血清濃度與糞便濃度關聯(lián)采用線性相關分析檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 糞便中英孚立昔單抗?jié)舛萒ab.1 Infliximab concentrations in fecal supernatant 14 days after the first infliximab infusion

表1 IFX 治療有效率Tab.1 Effects of Infliximab Induction

2 結果

2.1 入選CD 患者糞便IFX 檢測結果32位中重度回結腸型既往未接受IFX治療的CD患者入選。所有入選患者在第0、2、6周接受5 mg/kg IFX治療。在IFX治療后的前2周，32名患者中有27人（84.3%）的糞便中檢測到IFX，所有糞便樣本中有135人次（75.4%）的糞便中檢測到IFX。在首次注射IFX后的第1天測定的濃度最高［糞便濃度第1天：（7.14±0.87）mg/mL］，見圖1。其中第1天，在32例患者中的27例糞便樣本中檢測到IFX。糞便IFX濃度隨著時間持續(xù)下降。

表2 第2 周臨床反應率Tab.2 Week 2 clinical response ±s

表2 第2 周臨床反應率Tab.2 Week 2 clinical response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 臨床有效；NR，nonresponse 無效；ER，endoscopic response 內鏡有效

DAY 1 3 7 14 CR（IFX）1.04±0.58 0.31±0.11 0.34±0.09 0.21±0.07 NR（IFX）7.01±0.71 1.22±0.08 0.45±0.13 0.42±0.11 t/t′值2.80 2.31 1.51 0.95 P 值0.031 0.074 0.12 0.31

表3 第8 周內鏡反應率Tab.3 Week 8 endosopic response ±s

表3 第8 周內鏡反應率Tab.3 Week 8 endosopic response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 臨床有效；NR，nonresponse 無效；ER，endoscopic response 內鏡有效

DAY 1 3 7 14 ER（IFX）0.84±0.31 0.32±0.11 0.13±0.06 0.11±0.04 NR（IFX）4.14±0.61 1.31±0.34 0.41±0.22 0.30±0.11 t/t′值2.01 1.89 0.89 0.72 P 值0.062 0.074 0.21 0.42

表4 第3月臨床反應率Tab.4 Month 3 clinic response ±s

表4 第3月臨床反應率Tab.4 Month 3 clinic response ±s

注：IFX，infliximab；CR，clinical response 臨床有效；NR，nonresponse 無效；ER，endoscopic response 內鏡有效

DAY 1 3 7 14 CR（IFX）0.74±0.31 0.34±0.14 0.21±0.14 0.18±0.31 NR（IFX）2.81±0.66 0.64±0.34 0.31±0.17 0.14±0.31 t/t′值1.62 1.32 0.95 0.64 P 值0.10 0.21 0.32 0.57

表5 早期預測內鏡改善指標Tab.5 Early predictors for endoscopic response

第2周，血清中IFX濃度為（22.15±7.17）mg/mL。臨床有應答者：第2周觀察32例患者中的21例（67.7%），第3月觀察32例患者中的17例（53.1%）（表1）。

2.2 CD 患者糞便IFX 與臨床及內鏡應答32例患者中28例在第8周進行了第二次內窺鏡檢查，其中有12例（42.9%）有內鏡改善（SES-CD 3）。第2周時，無應答者在注射IFX后第1天糞中IFX濃度顯著高于第2周有應答者［（7.01±0.71）mg/mL vs.（1.04±0.51）mg/mL，P=0.031］，見表2。8周后內鏡無改善者，其糞便IFX相比內窺鏡評分改善的濃度較高［（4.14±0.61）mg/mL vs.（0.84±0.31）mg/mL，P=0.062］，見表3，但差異無統(tǒng)計學意義。

3月臨床無應答者，糞便IFX濃度更高［（2.81±0.56）mg/mL vs.（0.74±0.24）mg/mL，P=0.10］，如表4，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 CD患者糞便IFX與血清IFX和臨床參數的相關性分析進一步分析了包括C-反應蛋白（CRP）、血紅蛋白、血清白蛋白以及CDAI在內的多種生化及參數，其中糞IFX在第1天的濃度是內鏡對IFX反應的唯一預測因子（表5）。臨床無應答者第2周血清IFX中位濃度為（21.55 ± 5.12）mg/mL，而應答者為（23.15 ± 6.32）mg/mL。沒有直接觀察第一天IFX糞便水平和第二周IFX血清水平之間的相關性（r=-0.1 988，P=0.60，圖2）。

圖2 糞便IFX 濃度與血清IFX 濃度相關性Fig.2 Correlation feces IFX and serum IFX concentration

3 討論

本研究證實腸內抗TNF-α抗體丟失與有關中度至重度活動期CD患者IFX初治無效有關。本實驗表明糞便IFX濃度峰值為第一次注射大約1 d后，IFX最大的損失發(fā)生在血清藥物濃度最高時，且黏膜炎癥最重，因此，造成漏出的單抗最多。糞便中IFX明顯丟失的患者基線病情更為嚴重?；颊呋€血清白蛋白濃度、CRP、HB以及CDAI在預測IFX初治反應，無明顯價值。因為主要由回結腸疾病CD患者，疾病程度及糞便流失情況兩者之間無顯著相關性。

本研究只包括了CD患者，未納入潰瘍性結腸炎患者。然而，國外的一項研究中，入選和分析了IFX治療UC患者的糞便樣本。其中大部分患者的糞便也測量出IFX，這表明這種途徑的抗體丟失可能并不局限于CD［17］。在本研究中，觀察到初治無效較以前報道的高［19］，這很可能是由于這個特殊的隊列主要由中重度活動性克羅恩?。–DAI ＞220分）患者組成。雖然IFX的糞便丟失似乎是CD的初治無效的原因，但它可能不是影響IFX的藥代動力學唯一的因素［9-10］。早期糞便IFX濃度和第14天血清IFX濃度之間缺乏相關性，可由其他影響藥物血清濃度的因素來解釋。盡管有人認為IFX血清藥物濃度與臨床效果高度相關，最近的數據表明，黏膜濃度可能更重要的是，至少在嚴重的結腸炎中，結腸黏膜IFX濃度與臨床療效相關［20］。研究表明，黏膜抗TNF-α濃度與組織抗IFX單抗的比值，結腸炎癥嚴重部位其水平低于正常對照組，這表明黏膜炎癥是抗體丟失的可能原因［21］。結腸黏膜以及糞便IFX濃度可能可以預測CD初治患者有效性。

而本研究發(fā)現(xiàn)，血清英孚利息濃度與糞便IFX濃度無相關性，IFX的糞便丟失可能只是IFX清除途徑之一，還受其他因素影響。研究表明，IFX糞便內濃度其與網狀內皮系統(tǒng)內蛋白水解的相關。最近，利用熒光抗體的分子成像在腸道黏膜顯示結合TNF-α陽性的免疫細胞被認為是預測生物治療反應的一種潛在模式［22］。糞便中單克隆抗體的丟失也可能只是代表疾病活動程度，而與初治反應無因果關系。它還可以認為是疾病活動的生物標志物，可識別結腸切除術的高風險患者［23］。最近有研究表明腸道纖維化也可以降低IFX治療CD療效［24］，可能與降低病變腸黏膜IFX濃度有關。

本研究表明，抗TNF-α單抗可以在CD糞便中可被檢測到。但本研究可能保守估計了經腸道抗體丟失的數量，因為滲漏出的抗體蛋白可能已經被大量腸腔的蛋白酶降解部分。并且這項研究中使用的試劑盒只能檢測完整的抗體和Fab2片段，但無法檢測Fab片段或其他/進一步降解了的IFX片段。另外，糞便經過了冷凍保存了幾周才進行IFX濃度檢測，因此，部分抗體降解不能排除在外。另外，考慮患者的依從性，以及減少小腸粘膜損傷的糞便IFX濃度的影響，本研究只納入了回結腸型CD患者，且納入患者數量較少，納入中心單一，仍需更多臨床治療病例進一步證實IFX腸滲漏與IFX初治療效的關系。

綜上所述，腸內IFX的丟失在中重度CD與IFX初治無效有關。因此，重癥患者可能可以從更大劑量的給藥方案中，增加黏膜及血清IFX濃度從而獲益。