林中原 王益敏 張輝 林世清 劉德成 唐可京 張朝暉 竇云凌

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1麻醉科，3呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（廣州510080）；2廣東省第二人民醫(yī)院麻醉科（廣州510317）

肺癌骨轉(zhuǎn)移好發(fā)于脊柱和軀干骨近端，約50%肺癌骨轉(zhuǎn)移患者可出現(xiàn)骨癌痛，且隨著病情逐漸加重，嚴(yán)重影響患者情緒、睡眠和日常生活能力［1］。骨轉(zhuǎn)移癌痛（metastatic bone pain，MBP）作為一種難治性癌痛，包括靜息時持續(xù)性疼痛、靜息時自發(fā)或運動時誘發(fā)的爆發(fā)痛。盡管目前已有雙磷酸鹽、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的單克隆抗體等骨改良藥物的廣泛應(yīng)用，但是骨轉(zhuǎn)移癌痛的發(fā)生率仍居高不下，其原因是發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。目前，針對骨轉(zhuǎn)移癌痛的機(jī)制研究多集中于動物模型，而行為學(xué)實驗難以全面、準(zhǔn)確評估骨轉(zhuǎn)移癌痛的疼痛特點。RNA-seq技術(shù)是利用第二代高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究的方法，能夠針對特定組織或細(xì)胞的所有差異表達(dá)基因、基因變異等進(jìn)行研究，從而識別與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的核心基因。該技術(shù)在肺癌的分子病因?qū)W研究中取得了一系列的成果［2］，然而針對肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛的研究較少。本研究擬通過選擇典型肺腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛患者，利用RNA-seq技術(shù)篩選與骨轉(zhuǎn)移癌痛發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，并采用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行生物功能和生存分析研究，為臨床治療骨轉(zhuǎn)移癌痛提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。選擇我院2019年8月至2020年3月肺腺癌骨轉(zhuǎn)移患者11例，其中符合典型骨轉(zhuǎn)移癌痛臨床表現(xiàn)且疼痛視覺模擬評分（VAS）4分者作為骨轉(zhuǎn)移癌痛組（MBP組，n = 5），VAS評分為0分者作為對照組（C組，n = 6）。本研究中典型骨轉(zhuǎn)移癌痛患者臨床表現(xiàn)需滿足靜息時持續(xù)性疼痛、靜息時自發(fā)性爆發(fā)痛或運動時誘發(fā)性的爆發(fā)痛，且病程大于1個月。納入標(biāo)準(zhǔn)：年滿18歲；組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)明確診斷為肺腺癌者；脊柱部位骨病變活檢為肺癌轉(zhuǎn)移/具備典型的骨轉(zhuǎn)移影像學(xué)表現(xiàn)者，即局限病灶需MRI/PET-CT/骨組織活檢確診，廣泛病灶需PET-CT/CT/X線/MR確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個月內(nèi)對腫瘤部位或疼痛部位使用放射治療者，非癌性痛或非骨轉(zhuǎn)移部位引起疼痛者，明顯肝腎功能不全者，合并急/慢性感染性疾病，不能準(zhǔn)確描述疼痛部位及進(jìn)行疼痛評分者。每位受檢者用PAX gene管抽取外周血5 mL，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 RNA 提取、文庫構(gòu)建及測序采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行RNA降解和污染監(jiān)測。利用Agilent4200 TapeStation（Agilent technologies，CA，美國）系統(tǒng)檢測RNA完整性，采用帶有Oligo（dT）的磁珠對具有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA進(jìn)行捕獲并形成1stcDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物：包括DNA片段化處理、末端修復(fù)、加堿基A、加接頭以及PCR擴(kuò)增和文庫質(zhì)控等，最終建成文庫。接著對文庫進(jìn)行Illumina PE150測序，根據(jù)Illumina HiSeqTM 2500平臺測序獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads），經(jīng)過去除低質(zhì)量序列、去接頭污染等數(shù)據(jù)過濾過程得到高質(zhì)量的序列（clean reads）。利用RPKM（reads per kilobase of exon model per million mapped reads）值衡量基因的表達(dá)量。

1.3 差異表達(dá)基因篩選使用R軟件DEseq2［3］包對上述RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEGs）。本研究中如基因符合以下標(biāo)準(zhǔn)，則該基因被認(rèn)為是DEGs：DEseq2中的錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05；log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＜-1或log2 FC ＞1。使用ggplot2軟件包在R軟件中繪制火山圖。

1.4 通路與功能富集分析將DEGs導(dǎo)入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在線分析網(wǎng)站進(jìn)行GO（geneontology，GO）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）功能富集分析，分析其中涉及骨轉(zhuǎn)移癌痛的相關(guān)通路，以P.adjust ＜0.05為閾值篩選差異表達(dá)基因的富集分析結(jié)果。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析將DEGs導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）在線分析網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape軟件對上述PPI結(jié)果進(jìn)行可視化，并使用插件MCODE篩選出關(guān)鍵蛋白表達(dá)模塊及與骨轉(zhuǎn)移癌痛密切相關(guān)的基因，設(shè)置參數(shù)：Degree 6，K-core 2，NodeScore Cutoff 0.2及Max.Depth=100作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 生存分析將關(guān)鍵蛋白表達(dá)模塊內(nèi)的基因?qū)隚EPIA工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）［4］，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者臨床隨訪信息，包括生存狀態(tài)和總生存時間和，繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行l(wèi)og-rank統(tǒng)計檢驗；計算風(fēng)險比（hazard ratio，HR），分析關(guān)鍵節(jié)點基因的預(yù)后關(guān)系，P ＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選對比兩組基因表達(dá)差異，基于標(biāo)準(zhǔn)（|log FC|＞1 and P ＜0.05），找到2332個DEGs，其中上調(diào)基因1647個，下調(diào)基因685個。并利用ggplot2軟件包在R中繪制火山圖（圖1）。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano Map of differentially expressed genes

2.2 差異基因的通路與功能富集分析將DEGs導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO功能分析與KEGG通路富集分析，并按照P值從小到大展示前十位的GO條目（表1、圖2）及所有的KEGG富集通路（表2、圖3）。結(jié)果顯示差異基因主要功能富集表達(dá)于趨化因子信號傳導(dǎo)、p53信號通路、ECM受體相互作用等通路。

表1 前10 的GO 富集分析結(jié)果Tab.1 Top 10 GO enrichment analysis result

表2 KEGG 通路富集分析結(jié)果Tab.2 KEGG pathways enrichment analysis result

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選將差異表達(dá)基因?qū)隨TRING在線分析網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，利用Cytoscape軟件的MCODE插件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析并篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中重點蛋白表達(dá)模塊，設(shè)置參數(shù)：Degree 6，NodeScore Cutoff 0.2，K-core 2及Max.Depth=100作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到1個與骨轉(zhuǎn)移癌痛密切相關(guān)的蛋白表達(dá)模塊及4個關(guān)鍵基因（圖4）。

圖2 GO 富集分析結(jié)果Fig.2 GO enrichment analysis

圖3 KEGG 富集分析結(jié)果Fig.3 KEGG enrichment analysis

圖4 重點蛋白表達(dá)模塊Fig.4 The key protein expression module

2.4 生存分析為了探究模塊內(nèi)20個關(guān)鍵節(jié)點基因與肺腺癌的預(yù)后關(guān)系，利用TCGA隨訪數(shù)據(jù)結(jié)合關(guān)鍵節(jié)點基因表達(dá)值進(jìn)行生存分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GNG7高表達(dá)患者相比，肺腺癌患者中低表達(dá)GNG7患者生存率明顯降低（P ＜0.05）。見圖5。

3 討論

肺癌的發(fā)病率及死亡率居全國首位，其發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的概率高達(dá)10% ～15%，腺癌是其中最常見的病理類型［5］，骨轉(zhuǎn)移癌痛是癌癥中晚期患者經(jīng)常面臨的十分重要的問題，嚴(yán)重影響這類患者的生存質(zhì)量。傳統(tǒng)動物實驗主要通過脛骨或股骨注入肺腫瘤細(xì)胞獲得骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，不足以反映肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛患者疼痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

圖5 GNG7 生存曲線Fig.5 Survival curve evaluating the prognostic value of GNG7

本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛患者外周血細(xì)胞中CXCL1、CXCL10、CXCR4基因表達(dá)顯著上調(diào)。同時，在GO和KEGG功能富集分析中也發(fā)現(xiàn)了眾多基因在趨化因子信號傳導(dǎo)等炎性通路上顯著富集。既往研究表明，CXCL1和CXCL 10可誘發(fā)骨轉(zhuǎn)移癌痛大鼠痛覺過敏，使用受體拮抗劑或中和抗體抑制趨化因子信號通路，能夠有效減輕疼痛程度［6］。另外有證據(jù)表明趨化因子表達(dá)上調(diào)可以減弱阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用，大鼠脊髓鞘內(nèi)注射CXCL 10可減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛作用［7］，這可能為治療癌性爆發(fā)痛提供新思路。CXCR4是CXCL12的主要受體，多表達(dá)于脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［8］。SHEN等［8］研究顯示骨轉(zhuǎn)移癌痛大鼠脊髓組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)水平升高，并且可以通過致敏神經(jīng)元、激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移癌痛的發(fā)展。近期研究進(jìn)一步明確了脊髓神經(jīng)元中的CXCR4可以通過下游CaMKII/CREB通路誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)移癌痛大鼠痛覺敏化［9］。綜上所述，CXCL1、CXCL10和CXCR4可能參與了肺癌骨轉(zhuǎn)移灶腫瘤微環(huán)境的形成，并且可能通過誘導(dǎo)中樞敏化促進(jìn)癌性爆發(fā)痛發(fā)生，這些都為骨轉(zhuǎn)移癌痛的臨床治療提供理論依據(jù)。

進(jìn)一步對關(guān)鍵蛋白表達(dá)模塊內(nèi)的20個基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明低表達(dá)GNG7的肺腺癌患者生存率明顯降低（P ＜0.05）。文獻(xiàn)報道，GNG7（G蛋白γ7亞基）廣泛表達(dá)于各種組織，但在多種腫瘤細(xì)胞如胰腺癌、胃癌、食管癌等細(xì)胞中低表達(dá)［10］。GNG7既可以通過抑制mTOR通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡，也可以通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架抑制細(xì)胞分裂［10］，提示骨轉(zhuǎn)移癌痛的發(fā)生可能與GNG7的抗腫瘤作用減弱有關(guān)。另外，非癌性痛患者中GNG7也顯示出與疼痛發(fā)生的明顯相關(guān)性。NICULESCU等［11］研究提示GNG7可能作為一種疼痛抑制基因，在阿爾茲海默癥并重度疼痛狀態(tài)患者的血液中明顯低表達(dá)。同時，作者通過長期隨訪進(jìn)一步證實GNG7是阿爾茲海默癥患者發(fā)生重度疼痛的強預(yù)測因子［11］。另有證據(jù)表明疼痛相關(guān)疾病如糖尿病周圍神經(jīng)病變及椎間盤突出患者中也出現(xiàn)了GNG7基因的明顯差異表達(dá)［12-13］?；谝陨涎芯浚茰yGNG7作為抑癌基因延緩肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。同時，GNG7與多種疼痛疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可能成為骨轉(zhuǎn)移癌痛發(fā)生的重要預(yù)測因子。

本研究差異基因功能富集分析結(jié)果顯示趨化因子信號通路和p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在兩組患者出現(xiàn)表達(dá)差異，再次表明趨化因子的高表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移癌痛發(fā)生關(guān)系密切。P53信號通路是多種腫瘤發(fā)生中最常見的突變通路，在前列腺癌小鼠模型中，P53突變細(xì)胞群體對骨的親和力更高，容易誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的形成而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［14］。文獻(xiàn)報道，晚期肺癌表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）敏感突變患者易攜帶P53基因產(chǎn)生共突變，該亞克隆共突變事件促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移并極大地影響EGFR-TKI的療效［15-16］。而骨轉(zhuǎn)移患者肺原發(fā)灶與骨轉(zhuǎn)移灶EGFR和P53共突變高度一致［15］，表明EGFR和P53共突變可能是驅(qū)動肺癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的起始基因。另外，體外肺癌細(xì)胞實驗證明，功能獲得性P53基因表達(dá)能夠促進(jìn)EGFR信號通路的表達(dá)，而EGFR的表達(dá)又可以反式激活P53［17］。因此，P53和EGFR的共突變可能是驅(qū)動肺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

本研究不足之處在于尚未對肺腺癌患者的個體差異和疾病特質(zhì)性進(jìn)行分類，且未對疼痛程度進(jìn)行分層分析，同時沒有開展細(xì)胞或動物實驗驗證上述結(jié)論，后期將進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)方法，證明趨化因子/趨化因子受體CXCL1、CXCL10、CXCR4與GNG7參與了骨轉(zhuǎn)移癌痛的形成，其中趨化因子信號傳導(dǎo)通路和p53信號通路可能是肺腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛發(fā)生的重要機(jī)制，為臨床治療肺腺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛提供了重要預(yù)測因子和治療靶點。