黃曉珍 劉明星 許培 李浩賢 歐妙嫻 梁彩虹

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510150）

胚胎停育，是指胚胎發(fā)育到早孕期即發(fā)生死亡，發(fā)病率為10%～15%［1-2］，＞80%為孕12周內(nèi)的流產(chǎn)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent pregnancy loss，RPL）為連續(xù)2次以上的流產(chǎn)，其在育齡女性中的發(fā)病率為1% ～5%［3］。其病因復(fù)雜，與遺傳因素、生殖解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌紊亂、感染、免疫失衡、血栓前狀態(tài)、男方精液因素、環(huán)境因素以及個人不良生活習(xí)慣等有關(guān)［3］。明確流產(chǎn)原因，有利于減輕夫妻雙方身心、經(jīng)濟負擔(dān)，指導(dǎo)下一次妊娠，減少反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生。近50% ～70%流產(chǎn)絨毛可檢測出染色體異常，特別是在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者中，出現(xiàn)率高達60%［4］。染色體數(shù)目異常最常見，發(fā)病率高達90%，其中約60%為三體，20%為單體，15%為多倍體，嵌合體約占2%，而染色體結(jié)構(gòu)異常率為6%［5］。關(guān)于遺傳因素導(dǎo)致流產(chǎn)的機制及如何預(yù)防遺傳因素導(dǎo)致的不良妊娠，一直是優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會的研究重點之一。本研究通過回顧性分析本中心536例早期流產(chǎn)患者的絨毛染色體分析結(jié)果，探討絨毛染色體異常與早期胚胎停育的相關(guān)性及胚胎染色體異常的分布情況；研究胚胎染色體異常的危險因素，為臨床指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育提供證據(jù)支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2016年1月1日至2019年6月1日于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院確診為早期胚胎停育、行絨毛G顯帶染色體核型分析或染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）成功的患者共536例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)B超提示宮內(nèi)單胚胎停育；夫妻雙方染色體正常；流產(chǎn)絨毛染色體分析成功。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)多胎妊娠、異位妊娠或?qū)m內(nèi)外復(fù)合妊娠；夫妻一方或雙方染色體異常；不能成功檢測流產(chǎn)絨毛染色體；孕期接觸有害物質(zhì)；合并生殖解剖結(jié)構(gòu)畸形、感染、血栓前狀態(tài)、免疫紊亂及嚴重全身性疾病等。

本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均為匿名收集，數(shù)據(jù)僅用于統(tǒng)計分析。

1.3 方法（1）患者及其家屬簽署藥物流產(chǎn)或清宮的手術(shù)知情同意書及樣本留取同意書，留取流產(chǎn)絨毛；（2）根據(jù)病人意愿選擇行G顯帶染色體核型分析或CMA分析，流產(chǎn)絨毛送往本中心婦產(chǎn)科研究所臨床試驗部；（3）絨毛細胞培養(yǎng)及核型分析：挑取絨毛組織20 mg，剪成糊狀，加入1 mL酶解液，37 ℃水浴箱放置15 min；離心10 min，棄上清，加入4 mL培養(yǎng)液，吹打均勻后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)至顯微鏡下可看到10個克隆時加入秋水仙堿收獲，G顯帶。每份標(biāo)本計數(shù)30個分裂相，分析3個核型，出現(xiàn)嵌合體計數(shù)100個分裂相。G顯帶染色體核型分析結(jié)果根據(jù)國際人類細胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)（ISCN2013）描述；（4）CMA分析：采用Affymetrix公司供給的CytoScan HD芯片進行樣本單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism；SNP）和拷貝數(shù)變異（copy number variant；CNV）檢測。進行樣本限制性酶內(nèi)切、引物結(jié)合片段連接、PCR擴增、PCR產(chǎn)物片段化處理、生物素?zé)晒鈽?biāo)記、雜交和洗滌等步驟。芯片結(jié)果分析軟件為AGCC（Affymetrix GeneChip Convert Console）和CHAS（Chromosome Analysis Suite Version 2.0.0）。

1.4 分組根據(jù)流產(chǎn)絨毛染色體分析結(jié)果分為正常組和異常組。

1.5 臨床指標(biāo)收集收集兩組患者的臨床指標(biāo)，如患者年齡、孕次、流產(chǎn)次數(shù)、活產(chǎn)史、生化妊娠史、此次受孕方式、此次發(fā)現(xiàn)胎停的孕周等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。其中，組間率比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，多因素分析采用二分類logistic回歸分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期胚胎停育患者絨毛染色體異常的分布536例早期胚胎停育者中，檢出染色體異常的有331例，發(fā)生率為61.8%。經(jīng)染色體核型分析和CMA分析檢出染色體數(shù)目異常的有319例，發(fā)生率為59.5%（319/536），其中常見的依次是三體（70.2%）、三倍體（11.0%）及（45，X）（9.4%）。經(jīng)CMA分析檢出染色體結(jié)構(gòu)異常的有12例，發(fā)生率為5.4%（12/221）最常見的是缺失（66.7%）。

2.2 絨毛染色體三體的分布見圖1，三體以16-三體最常見，發(fā)生率為30.4%，隨之是22-三體，發(fā)生率為21.9%。

2.3 絨毛染色體異常危險因素的單因素和多因素分析將早期胚胎停育患者的年齡、孕次、活產(chǎn)史、生化妊娠史、流產(chǎn)次數(shù)、輔助生殖受孕等指標(biāo)進行分層，分別在兩組患者間作單因素分析，結(jié)果顯示，不同年齡組、有活產(chǎn)史組和無活產(chǎn)史組、自然受孕組和輔助生殖受孕組的染色體異常率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），比較不同孕次組、有生化妊娠史組和無生化妊娠史組、不同流產(chǎn)次數(shù)組的染色體異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05，表1）。將具有統(tǒng)計學(xué)差異的單因素協(xié)變量納入二分類Logistic回歸分析（向前法），結(jié)果顯示患者高齡是是絨毛染色體異常的危險因素，而輔助生殖受孕是是保護因素。見表2、3。

2.4 不同年齡組中不同類型絨毛染色體異常率的比較見表4，35歲組的數(shù)目異常率、非整倍體率、三體率及復(fù)合三體率均明顯高于＜35歲組（P ＜0.05）。兩組的單體率、嵌合體率及三倍體率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖1 不同類型染色體三體的分布Fig.1 Distribution of different types of chromosome trisomy

表1 絨毛染色體異常相關(guān)因素的單因素分析Tab.1 Univariate analysis of factors related to villi chromosome abnormalities 例

表2 絨毛染色體異?？赡芪ｋU因素編碼表Tab.2 Coding table of possible risk factors of villi chromosome abnormality

2.5 不同受孕方式組中不同類型絨毛染色體異常率的比較見表5，輔助生殖受孕組的數(shù)目異常率及三倍體率均低于自然受孕組（P ＜0.05）。兩組的三體率、單體率、嵌合體率及復(fù)合三體率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

3 討論

流產(chǎn)組織的遺傳學(xué)分析，證實了胚胎染色體異常是自然流產(chǎn)的主要原因［6-7］有胚胎染色體異常史的夫妻雙方可行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，減少因遺傳因素導(dǎo)致的后續(xù)不良妊娠［8］。本研究中早期胚胎停育患者中絨毛染色體異常的發(fā)生率為61.8%，高于RUSSO等［9］報道的50.3%。推測原因有：（1）本中心并非流產(chǎn)患者都行絨毛染色體分析，胚胎染色體異常的流產(chǎn)婦女占比更大；（2）RUSSO等［9］研究采用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization；FISH），檢測染色體數(shù)目異常的成功率高，且不能檢測染色體結(jié)構(gòu)異常；（3）本研究染色體異常組中高齡患者占44%，有一定的偏倚。另外，本研究發(fā)現(xiàn)不同流產(chǎn)次數(shù)患者的胚胎染色體異常率相當(dāng)，與YANG等［10］報道一致。因此，首次或多次流產(chǎn)患者，均有胚胎染色體異常的發(fā)生，有條件建議行流產(chǎn)組織的遺傳學(xué)檢查。

胚胎染色體異常中以數(shù)目異常最常見，結(jié)構(gòu)異常僅占極少數(shù)。數(shù)目異常中以非整倍體常見，如三體、性染色體單體等。整倍體中以三倍體常見。JIA等［11］檢測832例流產(chǎn)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)16、22三體出現(xiàn)最多，與本研究結(jié)果一致。三體出現(xiàn)的可能原因是卵母細胞在減數(shù)分裂Ⅰ期間一條或數(shù)條染色體不分離導(dǎo)致的非整倍體。隨著女性高齡，三體的發(fā)生率增加，染色體三體類型集中。本研究中嵌合體的檢出率為3.6%，稍低于彭繼萍報道的5.79%［12］，明顯低于報道的30%不等［13］，考慮與嵌合體本身特性、實驗人員技術(shù)、不同檢測方法標(biāo)準(zhǔn)不一有關(guān)。

表3 絨毛染色體異常危險因素二分類Logistic 回歸結(jié)果Tab.3 Results of binary logistic regression of risk factors for villi chromosome abnormality

表4 不同年齡組中不同類型絨毛染色體異常率Tab.4 Rates of different types of villi chromosome abnormality in different age groups 例（%）

表5 不同受孕方式組中不同類型絨毛染色體異常率Tab.5 Rates of different types of Chromosome abnormalities in different conception groups 例（%）

高齡是胚胎染色體異常的獨立危險因素之一［14-15］。本研究中，相比＜35歲女性，35歲女性發(fā)生胚胎染色體異常的風(fēng)險增加3倍以上，而對于40歲女性則風(fēng)險增加近6倍。女性高齡、卵巢功能下降、卵母細胞的線粒體數(shù)量及功能異常、紡錘體聚合檢驗點蛋白及cohesion減少影響紡錘體的聚合，導(dǎo)致胚胎染色體減數(shù)分裂早期染色體分離錯誤［9］。胚胎移植前產(chǎn)前診斷開展以來的臨床實踐也證實了這一點［16］。因此，預(yù)防胚胎染色體異常導(dǎo)致的胚胎停育，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，盡早受孕是重要舉措。

輔助生育技術(shù)的蓬勃發(fā)展使得婦女總體受孕率極大提高，但成功妊娠率卻低于30%［17］。有研究認為，注射大量促性腺激素釋放激素激動劑、卵細胞體外培養(yǎng)的氧化應(yīng)激、精子注射到卵細胞漿內(nèi)損傷細胞骨架或紡錘體［18-20］，均可能導(dǎo)致染色體的分離錯誤。但另有研究指出，輔助生育技術(shù)并不會增加胚胎染色體異常率［21-22］。本研究中輔助生育受孕患者發(fā)生胚胎染色體異常的可能性更小，特別是三倍體事件的發(fā)生，考慮可能與胚胎移植前常規(guī)進行胚胎形態(tài)學(xué)評分，優(yōu)選胚胎期間淘汰染色體可能異常、發(fā)育潛能低的胚胎等有關(guān)。MINASI等［23］學(xué)者也指出，囊胚移植前進行形態(tài)學(xué)評分，如評分高，其非整倍體發(fā)生率顯著低于形態(tài)評分差的囊胚。

本研究為單中心、單種族的回顧性研究，只納入了部分早期流產(chǎn)患者，受地域、人群、時間限制；另外，缺乏男方臨床資料以及對患者生活環(huán)境、習(xí)慣的調(diào)查。通過多中心、多種族、長時間的前瞻性研究能夠明確上述問題，從而更好地提高臨床咨詢和早期干預(yù)管理工作質(zhì)量，更好實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

綜上所述，胚胎染色體異常是早期胚胎停育的主要原因，以三體、三倍體及（45，X）較常見，三體中常見16、22-三體。女性高齡與胚胎染色體非整倍體率升高呈正相關(guān)；采用輔助生殖技術(shù)受孕不會增加胚胎染色體異常的發(fā)生。