鐘文德 鄧小燕 陳廣盛

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）；2廣州醫(yī)科大學(xué)金域?qū)W院（廣州510260）

在我國，舌癌患者以男性居多，大部分為舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）［1］。TSCC是口腔惡性腫瘤中最具侵襲性的一種，占口腔癌的41%。盡管在多模式診斷和治療技術(shù)上有了相當(dāng)大的進步，TSCC仍然是頭頸部最致命的癌癥類型之一［2］。腫瘤細(xì)胞可通過多種途徑來抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫耐受，而針對髓系來源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的免疫治療可能是對TSCC行之有效的新治療策略。MDSC是指在病理情況下，髓系細(xì)胞發(fā)育受阻而聚集的一群具有免疫抑制功能的異質(zhì)性細(xì)胞，是腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受的重要參與者［3-5］。既往研究［6］顯示舌癌患者外周血中MDSC細(xì)胞比例與臨床分期和病理分級正相關(guān)，提示MDSC可能是促使舌癌患者病情惡化的重要原因，然而目前具體機制尚不明確。因此，進一步探究MDSC在舌癌免疫學(xué)發(fā)病機制中的作用，對舌癌免疫治療的應(yīng)用和推廣有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集選取2017年1月至2019年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的舌癌（tonguecancer，TSCC）患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡25 ～75歲；（2）均經(jīng)病理學(xué)確診為舌癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其它系統(tǒng)嚴(yán)重疾病的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入40例舌癌患者，其中男28例（70%），女12例（30%）；臨床生長方式分為潰瘍型20例（50%），外生型11例（27.5%）以及浸潤型9例（22.5%）；臨床分期根據(jù)TNM分期分為早期（Ⅰ期與Ⅱ期，共18例，占45%）與晚期（Ⅲ期與Ⅳ期，共22例，占55%）；根據(jù)腫瘤細(xì)胞的分化等級，中分化最多20例（50%），其次為低分化15例（37.5%），高分化為5例（12.5%）；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例（42.5%），非轉(zhuǎn)移23例（57.5%）；有吸煙史、飲酒史的患者為35例（87.5%）。同時選取了年齡段接近的健康對照（healthy control，HC）51例，其中男31例（60.8%），女20例（39.2%），兩組間男女比例、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

1.2 主要試劑流式抗體CD45（APC-Cy7）、CD11b（PE-CF594）、CD33（BV421）、HLA-DR（PE -Cy7）、CD15（FITSCC）、CD4（PE）、CD8（APC）購自Biolegend公司；Trizol、ROS-DCF、S100A8及S100A9抗體購自Invitrogen公司。Western抗體β-actin、iNOS、Arg1、NOX2、S100A9購自Abcam公司。NOHA、LNMMA、NAC、CFSE、Ficoll分離液與膠原酶Ⅳ購自Sigma公司。

1.3 外周血分離PBMC 及MDSC 的流式檢測抽取靜脈血，用含EDTA抗凝管的采血管收集，加入等體積PBS混勻；用吸管將血稀釋液緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液Ficoll上層，18 ℃離心25 min；吸取白膜層，加PBS進行離心，裂解紅細(xì)胞，得到外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。取約5 × 106細(xì)胞進行流式染色，按照抗體說明書進行抗體孵育，進行流式上機檢測，收集數(shù)據(jù)后使用Flowjo軟件進行分析。

1.4 T 細(xì)胞增殖實驗流式分選CD3+的T細(xì)胞與MDSC（HLA-DR-CD11b+CD33+）［7］，將CD3+T細(xì)胞重懸于預(yù)熱的PBS+0.1%BSA中，加入CFSE（終濃度為2.5 μmol/L）；37 ℃孵育15 min后，終止染色；將T細(xì)胞與MDSC以不同的比例（1∶0、1∶8、1∶4、1∶2）進行共培養(yǎng)。并同時加入精氨酸酶抑制劑NOHA（100 μmol/L）、iNOS抑制劑L-NMMA（100 μmol/L）、ROS抑制劑NAC（1 mmol/L）處理，3 d后收集細(xì)胞進行CD4+和CD8+ T細(xì)胞進行染色，進行流式檢測其增殖情況。

1.5 舌癌組織中單個核細(xì)胞的分離及流式檢測將腫瘤及癌旁組織剪碎，充分研磨后過濾到離心管中，加入1 mg/mL的膠原酶Ⅳ進行消化，消化條件為37 ℃，210 r/min，消化30 min，隨后4 ℃450×g離心5 min去上清，紅細(xì)胞裂解液加至2 mL裂解約2 ～3 min，PBS沖洗并重懸至單細(xì)胞懸液，取約5×105細(xì)胞進行流式抗體標(biāo)記以及流式檢測。

1.6 qRT-PCR 與Western blot 檢測收集分選的MDSC樣品，參照Invitrogen公司的Trizol試劑使用說明書進行操作（qRT-PCR）。檢測基因序列見表1。Western蛋白印跡法實驗使用分選的MDSC細(xì)胞進行，按照相應(yīng)的說明書進行抗體的孵育以及條帶檢測。

表1 MDSC 分選qRT-PCR 引物Tab.1 Primers for MDSC separation

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism version 7.0a統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用非配對的t檢驗和ANOVA分析進行結(jié)果統(tǒng)計分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSCC患者外周血MDSCs水平增高與HC相較，TSCC患者外周血PBMC中MDSC水平出現(xiàn)顯著上升，比例如下：HC組（2.328±0.333 1），早期組（Early，8.29±1.791），晚期組（Late，13.56±1.456）。與HC組相比，早期組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）；與早期組相比，晚期組出現(xiàn)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022 8，圖1A、B）。該群細(xì)胞表達CD15，主要表現(xiàn)為多形核MDSC（PMNMDS）。S100A8與S100A9已被證實為調(diào)控MDSC發(fā)育與功能的重要因子，本研究使用流式分析發(fā)現(xiàn)S100A8與S100A9在舌癌患者MDSC中表達水平呈現(xiàn)增加（圖1C）。

2.2 TSCC患者外周血MDSCs抑制T細(xì)胞增值腫瘤中的MDSC具有很強的免疫抑制作用［8］。為了驗證TSCC中MDSC的功能，筆者進行了T細(xì)胞增殖實驗。將分選出來的CD3+ T細(xì)胞與MDSC細(xì)胞從PBMC中分選出來進行共培養(yǎng)。T細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，正常人體內(nèi)的MDSC無明顯抑制功能，而TSCC患者中MDSC具有較強的免疫抑制作用（T：MDSC比例為1∶4及1∶2時），提示TSCC外周血中的MDSC細(xì)胞具有較強的抑制T細(xì)胞應(yīng)答的能力（圖2A、B）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測舌癌患者外周血PBMC 中MDSC 的水平Fig.1 Detection of MDSC in TSCC patients′peripheral blood by Flow cytometry

圖2 T 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果Fig.2 The result of T cell proliferation assay

2.3 TSCC 患者MDSC 通過增加ROS 水平抑制T細(xì)胞增值在共培養(yǎng)的實驗組中加入了不同的通路抑制劑，發(fā)現(xiàn)加入ROS抑制劑后T細(xì)胞抑制功能得到了恢復(fù)，而使用其他抑制劑處理后無明顯改變（圖3A）。流式分選健康對照及TSCC患者PBMC中的MDSC細(xì)胞，進行mRNA水平的檢測，發(fā)現(xiàn)與ROS相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NOX2在舌癌組中表達增高（P = 0.004 5），S100A9作為陽性對照基因（圖3B）。Western blot檢測結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水平NOX2表達也顯著增高，與mRNA水平的結(jié)果相一致（圖3C）。同時，利用流式細(xì)胞術(shù)對MDSC中的ROS進行檢測，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，舌癌患者MDSC細(xì)胞中ROS含量顯著增加［HC為（47.4±5.492），TSCC為（73.67±4.388），P=0.020 2，圖3D、E］。

圖3 舌癌患者中MDSC 主要依賴于ROS 途徑來實施T 細(xì)胞抑制功能Fig.3 T cell inhibited by MDSC mainly relies on ROS pathway in TSCC patients

2.4 TSCC 患者腫瘤組織中MDSC 表型分析腫瘤及癌旁組織中消化分離得到細(xì)胞后，進行流式檢測。發(fā)現(xiàn)舌癌患者腫瘤組織以及相應(yīng)的癌旁組織免疫細(xì)胞分離結(jié)果顯示與癌旁組織相比，腫瘤中存在較高水平的MDSC，且表型與外周血中基本一致，說明在腫瘤微環(huán)境中MDSC可能發(fā)揮著重要的抑制功能。

3 討論

舌癌作為口腔頜面部的惡性腫瘤之一，其發(fā)病嚴(yán)重影響患者的生活，且該病具有發(fā)病年輕化的趨勢?；谀[瘤免疫的迅速發(fā)展，免疫治療是舌癌潛在的有效治療方法。研究［9］表明人體MDSC表達CD11b和CD33，缺乏成熟髓系細(xì)胞表面分子HLA-DR，其水平與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤中的MDSC通常具有很強的免疫抑制作用，靶向MDSC已成為腫瘤免疫治療的新策略。在口腔鱗癌以及食管鱗癌患者外周血中，存在較高水平的MDSC比例，這一現(xiàn)象在小鼠模型中也得到了驗證［10-11］。目前認(rèn)為S100A8和S100A9蛋白是MDSC的特征性蛋白，是促進MDSC擴增和活化的主要分子［12］。

人類MDSC表型在不同的腫瘤中有不同的表現(xiàn)。人類MDSC亞型主要是由表達不同的表面標(biāo)記物CD14和CD15來區(qū)分［13］。這兩個亞群的區(qū)別主要在于它們的功能，組織分布和調(diào)節(jié)機制不同［14-15］。有趣的是在絕大多數(shù)腫瘤模型中，腫瘤誘導(dǎo)的PMN-MDSC細(xì)胞占總MDSC的70%～80%［16］。PMNMDSC通過高表達ROS，從而抑制T細(xì)胞的增殖，而M-MDSC通過高表達NO抑制T細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)在舌癌患者的外周血和腫瘤組織中，MDSC細(xì)胞表達水平出現(xiàn)顯著增高，且隨著病情進展呈現(xiàn)出上升趨勢。該群細(xì)胞主要表達CD15以及MDSC的特征性蛋白S100A8及S100A9，說明該群細(xì)胞主要為粒細(xì)胞型MDSC。與正常人外周血的MDSC比較，舌癌患者中MDSC具有較強的抑制T細(xì)胞應(yīng)答的能力，提示在舌癌相關(guān)的腫瘤微環(huán)境中MDSC可能發(fā)揮著重要的免疫抑制功能，從而在促進腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸中起重要作用。因此，舌癌患者中MDSC細(xì)胞不僅表現(xiàn)為比例的增加，還表現(xiàn)為功能活性的增強。因為MDSCs擁有廣譜的免疫抑制活性，在得到可靠結(jié)論之前，它們對其他類型的免疫細(xì)胞的影響仍然需要被證實。

圖4 流式檢測舌癌腫瘤組織中MDSC 的水平Fig.4 Detection of MDSC in TSCC tissues by flow cytometry

基于以上結(jié)果，筆者進一步對參與其中的分子機制進行研究，通過加入不同的通路抑制劑與舌癌患者的MDSC與T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ROS的抑制劑可以阻斷該群MDSC對T細(xì)胞增值抑制的能力，提示舌癌患者中的MDSC可能主要依賴于ROS途徑來發(fā)揮T細(xì)胞抑制功能。MDSC通常通過高表達精氨酸酶1（ARG1）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）來發(fā)揮T細(xì)胞抑制功能，另外，在腫瘤中，MDSC中NADPH氧化酶（NOX2）表達上調(diào)，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）；ROS可抑制T細(xì)胞受體（TSCCR）中CD3ζ的表達，進而抑制腫瘤抗原特異的T細(xì)胞反應(yīng)［17-18］。以上研究成果為本次實驗結(jié)果提供了有力的理論基礎(chǔ)。以往研究證實多種炎癥相關(guān)因子（如GM-CSF，IL-6，IFN-γ等）促進了MDSC的擴增和活化［19］。在分子層面，目前認(rèn)為STAT-3、C/EBPβ、IRF8、Cox-2及S100A9等參與MDSC擴 增［20-21］，而STAT-1［22］、NF-κB［23］、STAT-6［24］等則主要調(diào)控MDSC活化。其中，鈣結(jié)合蛋白S100A9是調(diào)控MDSC擴增的重要分子，缺失S100A9可促進髓系細(xì)胞向下游分化，反正過表達S100A9則促進MDSC的擴增［25］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示舌癌患者的MDSC細(xì)胞中S100A9的表達水平明顯增高，提示舌癌促進了MDSC的擴增與活化，并且后續(xù)發(fā)現(xiàn)這一功能與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧ROS密切相關(guān)，這一結(jié)果為MDSC在舌癌免疫治療中的潛在應(yīng)用價值提供了新的思路，然而MDSC在舌癌發(fā)病機制中的具體作用仍有待進一步的探索。