王銘，司小萌，陳歡，郭培霞，張朔，梁玉柱

作者單位：南陽市中心醫(yī)院手術一部，河南 南陽473006

骨肉瘤是常見的多發(fā)生于青少年的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，具有較高的病死率［1］。目前，骨肉瘤的治療以手術為主，手術期是腫瘤發(fā)展最易受影響的階段［2］。手術期麻醉藥物的使用可抑制機體的免疫功能，增加腫瘤的轉移和復發(fā)［3-4］。羅哌卡因（Ropivacaine）是臨床常用的局部麻醉藥物之一，研究顯示，其可降低乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤細胞的增殖能力［5-6］。但目前，羅哌卡因對骨肉瘤的影響及作用機制還未知。miR-199b-5p是一種微小RNA（miRNA），參與多種腫瘤的發(fā)展進程。研究顯示，miR-199b-5p高表達與骨肉瘤病人預后不良密切相關，抑制miR-199b-5p表達降低了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，是骨肉瘤潛在的分子治療靶點［7］。本研究于2018年12月至2019年6月以骨肉瘤MG63細胞為研究對象，主要探討了羅哌卡因能否調(diào)控miR-199b-5p表達影響MG63細胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑骨肉瘤細胞系MG63，中國科學院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）試劑盒，北京索萊寶公司；胎牛血清，杭州四季青公司；噻唑藍（MTT）和胰蛋白酶，美國Sigma公司；鼠抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，日本TaKaRa公司；miR-199b-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）、抑制劑（antimiR-199b-5p）及陰性對照（anti-miR-NC），上海吉瑪公司；引物序列由上海生工生物技術公司設計并合成；LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 從液氮罐中取出裝有MG63細胞的凍存管，置于37℃水浴中使其快速溶解，轉移細胞凍存液于潔凈的離心管中。預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2次，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將對數(shù)增殖期的MG63細胞以5.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉染miR-199b-5p mimics、miR-NC、anti-miR-199b-5p及anti-miR-NC，轉染時間為6 h。然后更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理 未轉染的MG63細胞分為對照組（Con組）、低劑量羅哌卡因組（Ropivacaine-L組）、中劑量羅哌卡因組（Ropivacaine-M組）、高劑量羅哌卡因組（Ropivacaine-H組），其中Con組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，Ropivacaine-L組、Ropivacaine-M組、Ropivacaine-H組細胞分別用含20、50、100 mg/L［8］的羅哌卡因培養(yǎng)。轉染anti-miR-199b-5p、anti-miR-NC的細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別記為anti-miR-199b-5p組、anti-miR-NC組。轉染miR-199b-5p mimics、miRNC的細胞均用含50μg/mL羅哌卡因的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為Ropivacaine-M+miR-199b-5p組、Ropivacaine-M+miR-NC組。

1.2.3 細胞增殖檢測 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測Con組、Ropivacaine-L組、Ropivacaine-M組、Ropivacaine-H組、anti-miR-199b-5p組、anti-miR-NC組、Ropivacaine-M+miR-199b-5p組、Ropivacaine-M+miR-NC組細胞增殖［9］。MG63細胞以5×103個/孔接種于96孔板中，貼壁后，按“1.2.2”分組處理。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加20 μL MTT（5 g/L）。再孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加150μL二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標儀490 nm處測吸光度。

1.2.4 細胞凋亡檢測 流式細胞儀檢測Con組、Ropivacaine-M組、anti-miR-199b-5p組、anti-miR-NC組、Ropivacaine-M+miR-199b-5p組、Ropivacaine-M+miR-NC組細胞凋亡［10］。MG63細胞以5×104個/孔接種于24孔板中，貼壁后，按“1.2.2”分組處理。培養(yǎng)48 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS清洗細胞2次。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，采用流式細胞儀檢測。

1.2.5 MG63細胞中miR-199b-5p表達水平檢測實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）檢測Con組、Ropivacaine-M組、anti-miR-199b-5p組、anti-miR-NC組、Ropivacaine-M+miR-199b-5p組、Ropivacaine-M+miR-NC組MG63細胞中miR-199b-5p表達水平［11］。MG63細胞以5×104個/孔接種于24孔板中，貼壁后，按“1.2.2”分組處理。培養(yǎng)48 h后，收集細胞。Trizol試劑提取細胞中總RNA，并逆轉錄為互補DNA（cDNA）。以cDNA為模板，行PCR擴增。引物序列：miR-199b-5p正向5’-CCCAGTGTTTAGACTACCTGTTC，反向5’-GAATCGAGCACCAGTTACGC；U6正向 5’-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3’，反向 5’-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3’。2-△△Ct法計算miR-199b-5p相對于內(nèi)參U6的表達水平。

1.2.6 細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P21、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）表達水平檢測 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測Con組、Ropivacaine-M組、anti-miR-199b-5p組、anti-miRNC組、Ropivacaine-M+miR-199b-5p組、Ropivacaine-M+miR-NC組細胞中CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達水平［12］。MG63細胞以5×104個/孔接種于24孔板中，貼壁后，按“1.2.2”分組處理。培養(yǎng)48 h后，收集細胞。RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳。電泳后，轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），并于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別置于CyclinD1（1∶500）、P21（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育液中，37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

1.3統(tǒng)計學方法利用SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1羅哌卡因對細胞MG63增殖的影響與Con組比較，Ropivacaine-M組、Ropivacaine-H組MG63細胞在培養(yǎng)48、72 h后的吸光度降低（P＜0.05）。Con組、Ropivacaine-L組、Ropivacaine-M組、Ropivacaine-H組MG63細胞中Cyclin D1蛋白水平分別為（0.95±0.09）、（0.85±0.08）、（0.66±0.06）、（0.41±0.04），P21蛋白水平分別為（0.14±0.01）、（0.18±0.02）、（0.37±0.04）、（0.71±0.07）。與Con組比較，Ropivacaine-M組、Ropivacaine-H組MG63細胞中Cyclin D1和P21的蛋白水平均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由于Ropivacaine-M組MG63細胞培養(yǎng)48 h后抑制率約為50%，因此選用50μg/mL的羅哌卡因作用MG63細胞48 h進行后續(xù)實驗。見圖1、表1。

2.2羅哌卡因對細胞MG63凋亡的影響Con組MG63細胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水平分別為（7.66±0.75）%、（0.28±0.03）、（0.76±0.07），Ropivacaine-M組MG63細胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水平分別為（23.51±2.42）%、（0.89±0.09）、（0.20±0.02），兩組MG63細胞凋亡率、Bax和Bcl-2的蛋白水比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 不同劑量的羅哌卡因作用骨肉瘤細胞MG63 48 h后細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P21蛋白表達

表1 不同劑量的羅哌卡因對骨肉瘤細胞MG63增殖的影響/（A值，）

表1 不同劑量的羅哌卡因對骨肉瘤細胞MG63增殖的影響/（A值，）

注：Con組為對照組，Ropivacaine-L組為低劑量羅哌卡因組，Ropivacaine-M組為中劑量羅哌卡因組，Ropivacaine-H組為高劑量羅哌卡因組。與Con組比較，aP＜0.05

72 h 1.46±0.14 1.36±0.13 0.75±0.07a 0.51±0.05a 175.544＜0.001組別Con組Ropivacaine-L組Ropivacaine-M組Ropivacaine-H組F值P值重復次數(shù)9 9 9 9吸光度（490 nm）24 h 0.55±0.05 0.47±0.04 0.36±0.03a 0.29±0.02a 88.611＜0.001 48 h 0.92±0.09 0.88±0.08 0.49±0.05a 0.34±0.03a 165.771＜0.001

圖2 羅哌卡因中劑量對骨肉瘤細胞MG63凋亡蛋白表達的影響

2.3羅哌卡因對細胞MG63中miR-199b-5p表達的影響Con組、Ropivacaine-M組MG63細胞中miR-199b-5p表達水平分別為（0.82±0.08）、（0.13±0.01），且兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4抑制miR-199b-5p對細胞MG63增殖和凋亡的影響anti-miR-NC組MG63細胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表達水平分別為（0.98±0.09）、（7.66±0.75）%、（0.95±0.09）、（0.14±0.01）、（0.76±0.07）、（0.28±0.03），而 anti-miR-199b-5p組MG63細胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表達水平分別為（0.64±0.06）、（19.56±1.58）%、（0.40±0.04）、（0.53±0.05）、（0.36±0.03）、（0.71±0.07），兩組比較各檢測指標均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 抑制miR-199b-5p對骨肉瘤細胞MG63增殖、凋亡蛋白表達的影響

2.5過表達miR-199b-5p能逆轉羅哌卡因對細胞MG63增殖、凋亡的作用中劑量羅哌卡因+miRNC組MG63細胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表達水平分別為（0.36±0.03）、（23.35±2.34）%、（0.40±0.04）、（0.72±0.07）、（0.21±0.02）、（0.88±0.09），而中劑量羅哌卡因+miR-199b-5p組MG63細胞吸光度、凋亡率及Cyclin D1、P21、Bcl-2和Bax的蛋白表達水平分別為（0.58±0.06）、（12.68±1.23）%、（0.71±0.07）、（0.37±0.03）、（0.53±0.05）、（0.57±0.06），兩組各檢測指標比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 過表達miR-199b-5p能逆轉羅哌卡因對骨肉瘤細胞MG63增殖、凋亡蛋白表達的影響

3 討論

羅哌卡因是一種新型長效的局部麻醉藥，具有作用時間長、對心臟毒性小、麻醉效果確切等優(yōu)點，在臨床麻醉手術中被廣泛應用［13］。近幾年的研究顯示，麻醉藥影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，與腫瘤復發(fā)和轉移密切相關［14］。王文婷［15］研究顯示，羅哌卡因可抑制人結腸癌SW620細胞的增殖，并誘導其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。另有研究顯示，羅哌卡因可呈劑量依賴性降低乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長和遷移能力［16］。夏明等［17］研究顯示，羅哌卡因可能通過下調(diào)T細胞因子4（TCF-4）和 β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達水平降低人乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力。骨肉瘤多發(fā)于青少年，具有較高的病死率，嚴重威脅病人生命健康。細胞的異常增殖和凋亡是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的基礎［18］，通過藥物抑制骨肉瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，可改善骨肉瘤病人預后。目前，羅哌卡因對骨肉瘤增殖和凋亡的影響還未知。

Cyclin D1參與調(diào)控細胞周期，其表達增加可加速細胞增殖［19］。P21是目前公認的腫瘤抑制因子［20］?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax參與細胞的凋亡過程，Bcl-2蛋白表達降低或Bax蛋白表達升高可誘導細胞凋亡［21］。本研究結果顯示，50、100μg/mL的羅哌卡因分別作用MG63細胞48、72 h后，MG63細胞增殖能力顯著降低，Cyclin D1蛋白水平降低，而P21蛋白水平升高，但是20μg/mL的羅哌卡因作用MG63細胞后，MG63細胞增殖能力、Cyclin D1和P21蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義，說明一定濃度的羅哌卡因可抑制MG63細胞增殖。本研究還顯示，50μg/mL的羅哌卡因可提高MG63細胞凋亡率及Bax蛋白表達水平，降低Bcl-2蛋白水平，說明羅哌卡因可抑制骨肉瘤細胞增殖，并誘導其凋亡，是治療骨肉瘤的潛在藥物。

作為一種miRNA，miR-199b-5p在肝細胞癌、腎細胞癌和乳腺癌等腫瘤中呈低表達，作為抑癌基因參與這些腫瘤的發(fā)展過程［22-24］。楊澄等［25］研究顯示，miR-199b-5p在骨肉瘤中高表達，是骨肉瘤診斷的潛在生物學標志物。但目前，miR-199b-5p對骨肉瘤細胞惡性行為的影響還未知。本研究顯示，抑制miR-199b-5p表達降低了骨肉瘤細胞的增殖能力，并誘導了細胞凋亡，提示miR-199b-5p作為促癌基因促進骨肉瘤的發(fā)展進程，可能是骨肉瘤治療的潛在分子靶點。本研究還顯示，羅哌卡因降低了骨肉瘤細胞MG63中的miR-199b-5p表達，而過表達miR-199b-5p逆轉了羅哌卡因對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用和凋亡促進作用，提示羅哌卡因通過下調(diào)miR-199b-5p表達來抑制骨肉瘤細胞的惡性行為。

綜上，羅哌卡因可降低骨肉瘤細胞的增殖能力，并誘導細胞凋亡，機制可能與下調(diào)miR-199b-5p表達有關，具有治療骨肉瘤的潛在價值。本研究還存在一定的不足之處，接下來將深入探討miR-199b-5p下游靶基因及信號通路對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響，且進一步通過動物實驗驗證羅哌卡因能否調(diào)控miR-199b-5p信號通路影響骨肉瘤的發(fā)展進程。