吳越，馬建忠，胡園，許凱倫，周朝生

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005)

石斑魚是鮨科(Serranidae)石斑魚屬魚類的總稱，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，現(xiàn)已成繼大黃魚、鲆魚和鱸魚后的第四大類海水養(yǎng)殖品種。隨著石斑魚市場需求的日益上升，其養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大，養(yǎng)殖密度不斷增加，養(yǎng)殖病害時有發(fā)生。哈維氏弧菌是引起石斑魚發(fā)病的主要致病菌之一，可引發(fā)皮膚潰瘍病、突眼癥等疾病[1-2]，嚴重影響了養(yǎng)殖效益。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制哈維氏弧菌病最直接有效的手段是抗菌藥物防治。

噁喹酸是第二代喹諾酮類抗菌藥，有抗菌譜廣、抑菌濃度低、抗菌效果明顯等優(yōu)點，我國農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局在農(nóng)漁養(yǎng)[2000]17 號文件中推薦使用，為水產(chǎn)專用抗菌類藥物，被廣泛用于海水魚類的細菌性疾病，尤其是弧菌病的治療[3-4]。但現(xiàn)有國標及規(guī)范中關(guān)于噁喹酸用藥方案和休藥期較為籠統(tǒng)，缺乏針對具體品種水產(chǎn)動物的個體化用藥方案。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中盲目用藥現(xiàn)象仍然普遍存在，這不僅會使水產(chǎn)品中的藥殘超標，更是容易導(dǎo)致病原微生物對抗菌藥耐藥性的不斷增強。因此，在抗菌藥物使用中制定既有良好的臨床療效，又能防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴增的科學(xué)給藥方案顯得尤為重要。目前對于水產(chǎn)用抗菌藥給藥方案的制定大多基于對于藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)(Pharmacokinetic，PK)的研究[5-6]，而對于防耐藥方面很少涉及。防細菌耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC) 和耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論的提出為限制耐藥突變菌株選擇性擴增提供了新的思路。MPC 是指抑制細菌耐藥突變體被選擇性富集擴增所需的最小抗菌藥物濃度，MSW指最小抑菌濃度(MIC)和MPC之間的濃度范圍。當(dāng)抗菌藥物濃度維持在MPC之上時，MSW關(guān)閉，可限制耐藥突變株的出現(xiàn)。本研究測定了噁喹酸對哈維氏弧菌的最小抑菌濃度及噁喹酸在石斑魚體內(nèi)的藥物代謝規(guī)律，分析了藥動學(xué)(Pharmacokinetic，PK)/藥效學(xué)(Pharmacodynamic，PD)聯(lián)合參數(shù)，并結(jié)合MPC和MSW理論，制定了噁喹酸在石斑魚中的防耐藥給藥方案。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

噁喹酸原粉濃度≥99.0%，乙腈、正己烷、甲酸等為HPLC級，噁喹酸標準物質(zhì)≥98.0%，肝素鈉(上海安譜實驗科技股份有限公司)。無水硫酸鈉(分析純，溫州金山化學(xué)試劑儀器公司)，650 ℃烘4 h后，保存于干燥器中。

1.2 主要儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜配熒光檢測器(Waters公司)；5810R離心機(eppendorf公司)；WD-12氮吹儀(上海安譜公司)；LRH-150F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ZHWY-2012恒溫振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.3 供試動物及菌株

健康石斑魚150尾，平均體重(500±50)g，養(yǎng)于浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所洞頭基地，養(yǎng)殖水溫為(25±3)℃；隨機抽取檢測，未檢出噁喹酸；養(yǎng)殖期間每天投喂不含噁喹酸的飼料。試驗用哈維氏弧菌菌株H11由本單位前期從發(fā)病魚體內(nèi)分離鑒定并保存。

1.4 給藥方式與劑量

噁喹酸注射用藥液配置參考文獻[7]。稱取噁喹酸1.500 0 g，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶解，用6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH至10.5，用0.9%氯化鈉水溶液定容至100 mL，配成15 mg·mL-1的注射用藥液，注射劑量分別為10、20、30 mg·kg-1，肌肉注射給藥。

1.5 取樣

在給藥后0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12、24和48 h，取尾靜脈血于含有1%肝素鈉的離心管中，分離血漿。在給藥后0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12、24、48、72、96、144、192、288、382和584 h，取肌肉組織。血樣和肌肉組織均保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.6 組織中噁喹酸的測定

肌肉前處理方法參考SC/T 3028—2006[8]標準中樣品制備的操作步驟。血樣前處理方法參考文獻[9]。取樣品1 mL，置于25 mL離心管中，加入干燥的乙酸乙酯液20 mL，無水硫酸鈉1 g，超聲提取5 min。于3 000 r·min-1離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL茄形瓶中。于50～55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，馬上加入1 mL流動相溶解，再加入1 mL正己烷于漩渦混合器上充分振蕩，轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，于3 000 r·min-1離心5 min，取下層清液，用濾器過濾至進樣瓶中。

色譜條件。色譜柱為安捷倫C18；流動相為1%甲酸水溶液-乙腈(70+30)；流速1.0 mL·min-1，檢測器波長：激發(fā)波長312 nm，發(fā)射波長366 nm，進樣量50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外藥效

噁喹酸對哈維氏弧菌H11菌株的MIC為1.0 mg·L-1，MBC為2.0 mg·L-1。將濃度為1、2和4 MIC的噁喹酸藥液與H11菌株菌懸液接觸1 h后，PAE分別為(1.97±0．05)、(2.54±0.12)、(2.79±0.08)h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1～4 MIC，隨著藥物濃度的升高，PAE時間延長，表明噁喹酸對菌株的PAE呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。對照組C1與藥物殘留對照組C2中細菌生長曲線基本保持一致，說明400倍稀釋可去除藥物(圖1)。噁喹酸對H11的MPC為4.0 mg·L-1，MSW范圍為1～4.0 mg·L-1，表明當(dāng)噁喹酸濃度在1～4 mg·L-1的范圍時，細菌耐藥突變株可能被選擇性富集擴增；當(dāng)藥物濃度高于防耐藥突變濃度4.0 mg·L-1時，即可減少耐藥突變菌株的發(fā)生概率，又可達到理想的殺菌效果。

圖1 噁喹酸對菌株H11的抗生素效應(yīng)

2.2 不同劑量噁喹酸在石斑魚血漿中的代謝規(guī)律

分別對石斑魚進行10、20、30 mg·kg-1體質(zhì)量劑量的噁喹酸給藥后在各時間點采樣，經(jīng)高效液相色譜檢測血漿中噁喹酸濃度并擬合藥時曲線(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組劑量的噁喹酸在石斑魚血漿中的變化規(guī)律基本一致，都在0.5 h就已達到峰值，之后呈下降趨勢，且速度較快。隨著給藥劑量的升高，藥物在血漿中的含量也升高。

圖2 不同給藥劑量下石斑魚血漿中噁喹酸的藥時曲線

2.3 不同劑量噁喹酸在石斑魚血漿中的藥物代謝動力學(xué)分析

將不同給藥劑量下噁喹酸在石斑魚血漿中的藥時數(shù)據(jù)通過藥代動力學(xué)軟件winNonln5.2.1進行房室模型擬合，表1結(jié)果表明，噁喹酸在石斑魚血漿中的藥時數(shù)據(jù)均符合一級吸收二室模型。

表1 不同劑量噁喹酸在石斑魚血漿中的藥動學(xué)方程

表2顯示，隨著給藥劑量濃度的升高，藥時曲線下面積和消除半衰期均升高，消除速率降低。藥動學(xué)方程為給藥方案的制定提供了理論參考，藥物代謝動力學(xué)參數(shù)尤其是AUC24、Cmax和Tmax等是制定給藥方案的重要參數(shù)。

表2 不同劑量噁喹酸在石斑魚血漿中藥動學(xué)參數(shù)

2.4 藥代/藥效動力學(xué)聯(lián)合參數(shù)研究

由圖3可知，結(jié)合噁喹酸對哈維氏弧菌H11的體外藥效和在魚體內(nèi)藥動學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10、20、30 mg·kg-1劑量的噁喹酸給藥后，AUC24/MIC分別為61.862 8、135.964 7和199.113 9；Cmax/MIC分別為10.859、13.870和17.817；血漿藥物濃度大于MPC的維持時間分別為3、24、36 h。研究表明，AUC24/MIC、Cmax/MIC是預(yù)測抗菌藥物療效的重要參數(shù)，當(dāng)AUC24/MIC≥125或Cmax/MIC>8時，可獲得良好的臨床療效。本研究中20和30 mg·kg-1劑量下均滿足AUC24/MIC≥125及Cmax/MIC>8的要求，且血藥濃度大于MPC時間均維持在24 h以上，因此，確定最佳的給藥劑量為20 mg·kg-1，每日給藥1次，根據(jù)療效可連續(xù)給藥幾日。

圖3 不同劑量噁喹酸在石斑魚血漿中不同時間的藥物濃度與MIC、MPC及MSW的關(guān)系

2.5 休藥期的確定

本研究將肌肉作為藥物殘留的檢測組織，參考日本肯定列表中噁喹酸殘留限量(MRL)0.05 mg·kg-1，以已確定的給藥劑量20 mg·kg-1計算休藥期。分析藥物代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在給藥12 d后，肌肉中噁喹酸含量為(0.057±0.014)mg·kg-1，在給藥16 d后，肌肉中噁喹酸含量為(0.007±0.002)mg·kg-1，因此，建議石斑魚中噁喹酸休藥期為16 d。

3 討論

本試驗開展了噁喹酸對哈維氏弧菌的體外藥效學(xué)及其在石斑魚體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。藥效學(xué)結(jié)果顯示，噁喹酸對本研究中哈維氏弧菌的MIC值為1 mg·L-1。王元等[10]分析了噁喹酸對132株弧菌的MIC值分布于0.15～1.25 mg·L-1，與本研究中噁喹酸的MIC值較為一致，表明噁喹酸對弧菌有較好的抑菌效果。李健等[4]研究發(fā)現(xiàn)，噁喹酸對海水養(yǎng)殖動物中哈維氏弧菌、溶藻弧菌、坎貝氏弧菌和副溶血弧菌以及淡水嗜水氣單胞菌均有明顯的抑菌效果。因此，在石斑魚養(yǎng)殖中可以考慮選擇噁喹酸來治療弧菌引發(fā)的病害。

藥動學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肌肉注射給藥后噁喹酸在石斑魚體內(nèi)的代謝符合一級吸收二室模型。梁增輝等[7]通過血液注射給藥后發(fā)現(xiàn)噁喹酸在鰻魚體內(nèi)符合一級消除二室模型。而林麗聰?shù)萚11]研究表明，口灌給藥后噁喹酸在歐洲鰻鱺體內(nèi)的代謝動力學(xué)符合一級吸收一室開放模型，浸浴給藥方式下噁喹酸經(jīng)時過程則符合一級吸收二室開放模型。以上研究結(jié)果表明，種屬間差異和給藥方式不同都會影響噁喹酸的代謝規(guī)律。血藥Cmax、Tmax和AUC是反映藥物在體內(nèi)吸收快慢程度和評價體內(nèi)藥效的重要指標，而消除半衰期(t1/2β)是評價藥物消除快慢的重要參數(shù)。關(guān)于噁喹酸的藥物代謝動力學(xué)研究主要集中于魚類中。Rigos G等通過10 mg·kg-1劑量血管注射給藥噁喹酸后分析其在金頭鯛體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)[12]，Cmax為(11.617±3.013) mg·L-1，Tmax為0.5 h，t1/2β為10.71 h，與本試驗結(jié)果較為相似，AUC為53.5 mg·h·L-1，比在石斑魚中小。孫愛榮[13]研究了24.5 ℃水溫下以10 mg·kg-1劑量單次靜注噁喹酸后大菱鲆中的藥代動力學(xué)，其Cmax為18.89 mg·L-1，AUC72為99.069 mg·h·L-1，與本試驗結(jié)果也較為相似，Tmax為0.083 h，達峰時間早于石斑魚，t1/2β為24.441 h，其消除速度明顯小于石斑魚[13]。孫朋輝等[14]研究了25 ℃水溫下口灌20、30、40 mg·kg-1劑量噁喹酸后在異育銀鯽體內(nèi)藥代動力學(xué)，Cmax為4.1～8.87 mg·L-1，Tmax均為1 h，AUC24為21.624 1～39.184 6 mg·L-1。由此可見，受試品種和給藥方式對噁喹酸的吸收與消除有影響。噁喹酸以肌肉注射給藥石斑魚后在魚體內(nèi)的吸收效果較好，與一些魚類品種靜脈注射的結(jié)果較為相近，而消除速度可能比靜脈注射要慢，有助于血藥濃度保持在一個較高的水平。

在制定抗菌藥物給藥方案時，需要綜合考慮藥物對致病菌的體外藥效以及藥物在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。研究認為，喹諾酮類藥物對革蘭陰性菌的0～24 h內(nèi)藥—時曲線下面積/最小抑菌質(zhì)量濃度為100～125時或Cmax/MIC>8，有良好的臨床療效[15-17]。但傳統(tǒng)的通過藥效學(xué)/藥代學(xué)聯(lián)合參數(shù)制定給藥方案時往往僅考慮AUC24/MIC、Cmax/MIC和T>MIC等預(yù)測藥物臨床療效的指標，而這種給藥方案中并未涉及預(yù)防耐藥菌株的產(chǎn)生。在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中抗菌藥物濫用現(xiàn)象普遍存在，細菌耐藥性情況日趨嚴峻，已經(jīng)成為研究熱點問題。MPC、MSW理論的提出彌補了傳統(tǒng)藥效學(xué)/藥代學(xué)聯(lián)合參數(shù)未考慮限制致病菌產(chǎn)生耐藥性的不足之處。當(dāng)抗菌藥物濃度處于MSW內(nèi)時，細菌耐藥突變株可能被選擇性富集擴增，但當(dāng)抗菌藥物濃度高于MPC時耐藥株的富集就會被抑制。已有MPC和MSW在水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥中的相關(guān)研究。李夢影等[18]根據(jù)AUC24/MIC>125或Cmax/MIC>8～10標準，綜合血藥濃度維持MPC以上的時間超過(24-PAE)h，確定了氟苯尼考防治嗜水氣單胞菌引起的鯽和草魚細菌性敗血癥的給藥方案。徐麗娟等[19]利用MPC和MSW 理論并結(jié)合藥代動力學(xué)(PK)參數(shù)，制定了恩諾沙星防耐藥突變用藥方案控制由嗜水氣單胞菌引起的鯽細菌性敗血癥。本研究中20和30 mg·kg-1劑量下均滿足AUC24/MIC>125及Cmax/MIC>10的要求，且血藥濃度>MPC的持續(xù)時間分別為24和36 h。體外藥效試驗結(jié)果顯示，在MPC濃度下，噁喹酸對哈維氏弧菌的PAE持續(xù)2.79 h以上。因此，在20 mg·kg-1劑量下，血藥濃度>MPC發(fā)揮抗菌療效的時間已經(jīng)完全可以達到(24-PAE) h以上。由此建議，在控制石斑魚哈維氏弧菌感染時，采用20 mg·kg-1的肌肉注射給藥劑量，給藥間隔時間為24 h，既可獲得良好的療效，又可預(yù)防耐藥菌的出現(xiàn)。