劉君，米敏，郭方其，王驕陽，黑銀秀*

(1.臺州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 臺州 3170002； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

郁金香(TulipagesnerianaL.)是世界著名花卉，近年來郁金香展蓬勃發(fā)展，每年從荷蘭進口的郁金香品種和數(shù)量急劇增長。2019年僅江蘇省就從國外引進300多個品種、3 000萬粒郁金香種球用于郁金香文化月花海布置[1]。國內(nèi)花展用球幾乎都從國外進口，造成大量外匯流失。

通過傳統(tǒng)分球方法進行郁金香種球繁殖，繁殖系數(shù)較低且品種易退化[2]，而以郁金香鱗莖、花莖及其他材料為外植體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行郁金香種球的快速繁殖，不僅能保持原品種的優(yōu)良特性，且繁殖系數(shù)高，是郁金香種球產(chǎn)業(yè)化繁育的重要手段。國外對郁金香組織培養(yǎng)的研究較多，主要以莖段[3-4]、腋芽[5-6]、球莖[7]、花莖[8]等作為外植體，且大部分研究都是先形成愈傷組織再分化出小芽。國內(nèi)快繁研究多以鱗莖作為外植體，以直接誘導分化小鱗莖或小芽為主，研究方向主要集中在環(huán)境調(diào)控、激素配比篩選上，但繁殖系數(shù)不高，還未能在實際生產(chǎn)中應用[9]。本研究以郁金香鱗莖為外植體，研究不同取材時間、不同層鱗片誘導再生小鱗莖的效果，以期為郁金香的快速繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試郁金香品種為法國之光(Iie de France)，2018年12月至次年3月在臺州市農(nóng)科院小溪基地種植，4月采收種球，經(jīng)消毒風干后置于溫度(20±2) ℃、濕度(60±5)%的貯藏室存放，9—11月在5 ℃冷庫存放。

1.2 消毒方式

挑選無病害郁金香種球，清理干凈并剝掉外層褐色種皮，用自來水沖洗5 min，于超凈工作臺上預備消毒。除進行消毒方式篩選試驗外，其他試驗消毒方式均采用75%酒精浸泡2 min取出，用無菌水沖洗2次及2%次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡20 min后取出，再用無菌水沖洗3次。

1.3 接種、培養(yǎng)與統(tǒng)計

將郁金香鱗片切成5～8 mm小塊進行接種。采用MS基本培養(yǎng)基，含3%蔗糖和0.45%瓊脂粉，不同處理添加不同濃度激素，pH值調(diào)為5.8。每處理接8～10瓶，每瓶接4個外植體。培養(yǎng)條件為光照12 h·d-1，溫度(25±2)℃。觀察記錄鱗片生長情況，1周后統(tǒng)計污染情況，30 d后統(tǒng)計誘導分化結(jié)果(不計污染，下同)。

1.4 試驗方法

1.4.1 不同消毒方式對郁金香鱗片污染率的影響

2019年2月18日，田間郁金香處于蕾期，采挖種球進行試驗。試驗設3個消毒處理。T1為75%的酒精浸泡1 min，用無菌水沖洗2次，2%NaClO浸泡10 min，用無菌水沖洗2次。T2為75%酒精浸泡2 min，2%NaClO浸泡20 min，其他方式同T1。T3為75%酒精浸泡2 min，5%NaClO浸泡10 min，其他方式同T1。

1.4.2 不同層鱗片分化的差異

2019年3月27日田間植株處于更新球膨大期，取平均周徑大于10 cm的更新球作為試驗材料。該階段更新球外面仍包著一層老鱗片，老鱗片干皺不飽滿。試驗設4個處理，從外向內(nèi)分別取更新球的不同層鱗片，即外層鱗片(第1層)(后期會形成膜質(zhì)種皮保護種球)、中層鱗片(第2層)、內(nèi)層鱗片(第3層)、中心芽體(第4層)。將鱗片切成0.5 cm見方，凸面朝上接種到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中。

1.4.3 帶有底盤的鱗片的分化情況

2019年7月31日，室內(nèi)貯藏的郁金香種球已完成花芽分化，取平均周徑大于10 cm的種球作為試驗材料，此時種球最外層鱗片已完全褐化變?yōu)槟べ|(zhì)外皮。該試驗設3個處理，從外向內(nèi)分別取中層鱗片(第2層)、內(nèi)層鱗片(第3層)、中心芽體(第4層)進行接種。將不同層的帶有底盤結(jié)構(gòu)的鱗片接種到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上。

1.4.4 小鱗莖的增殖情況

將試驗中誘導得到的小鱗莖轉(zhuǎn)接到6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察小鱗莖的生長和增殖效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對郁金香鱗片成活的影響

由表1可見，隨著消毒時間的增加和NaClO濃度的升高，污染率逐漸降低。T3的鱗片污染率為10.17%，明顯低于T1和T2。但經(jīng)T3處理消毒的鱗片，培養(yǎng)4周后部分鱗片邊緣由乳白色變成為褐色，并逐漸死亡，可能是高濃度的NaClO對鱗片組織造成損傷。為了提高后期成活率，建議使用T2處理對郁金香鱗片進行消毒。

表1 不同消毒方法對郁金香鱗片接種污染率的影響

2.2 不同層鱗片對愈傷誘導和小鱗莖再生的影響

培養(yǎng)2周后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，第1層鱗片開始膨大，并由白色轉(zhuǎn)為淡黃色，培養(yǎng)4周后，中心顏色變綠，邊緣變褐，60 d后沒有轉(zhuǎn)接的愈傷組織邊緣變黑直至死亡。表2表明，隨著接種鱗片部位由外向內(nèi)選擇，愈傷組織誘導率逐漸減小，而小鱗莖誘導率逐漸增大。第1層鱗片即外層鱗片的愈傷誘導率高達88%，但未誘導出小鱗莖；第2層鱗片的大小和組織結(jié)構(gòu)沒有變化。第3和4層鱗片誘導小鱗莖效果明顯，其小鱗莖誘導率分別為25.00%和57.89%(圖1)。

表2 不同層鱗片對愈傷誘導和小鱗莖再生的影響

A、B、C、D分別為郁金香第3、4、1和2層鱗片培養(yǎng)4周后誘導出的小鱗莖和愈傷組織。圖1 不同層鱗片誘導分化出的愈傷組織和小鱗莖

2.3 帶有底盤的鱗片的分化情況

培養(yǎng)4周后調(diào)查發(fā)現(xiàn)(表3)，與2.2試驗結(jié)果一樣，第2層鱗片組織基本沒有變化，既沒有誘導出愈傷也沒有誘導出小鱗莖。與2.2試驗不同的是，無論第3層鱗片還是第4層鱗片都沒有誘導出愈傷組織，但出現(xiàn)了很多綠葉組織(圖2)。第4層綠葉和小鱗莖誘導率都顯著高于第3層鱗片，其中葉片誘導率為31.67%，小鱗莖誘導效果更明顯，誘導率高達73.33%。

表3 不同層鱗片誘導產(chǎn)生愈傷組織及小鱗莖的比較

A、B為郁金香第4層鱗片培養(yǎng)4周后誘導出的小鱗莖；C、D為郁金香第4層鱗片培養(yǎng)4周后誘導出的綠葉組織。圖2 帶有底盤的不同層鱗片誘導分化出的小鱗莖和綠葉組織

2.4 小鱗莖的增殖情況

2019年7月31日將帶有郁金香小鱗莖的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基。圖3是轉(zhuǎn)接之前和轉(zhuǎn)接4周后的增殖效果。由圖可知，轉(zhuǎn)接后芽顯著增大、增多，增殖系數(shù)高達30，表明該培養(yǎng)基配方適合小鱗莖增殖。

E、F分別為郁金香鱗片轉(zhuǎn)接前(7月31)和轉(zhuǎn)接4周后(8月27)。圖3 小鱗莖增殖和生長情況

圖4是7月31日內(nèi)層鱗片在MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)誘導得到的小鱗莖，并于10月10日、12月11日、1月20日在MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基上進行轉(zhuǎn)接，小鱗莖顏色濃綠、健壯、數(shù)量增多，生長狀態(tài)良好，表明該配方適合小鱗莖生長。

A、B、C分別為12月20日、1月22日和2月27日拍攝。圖4 小鱗莖生長情況

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，選用75%酒精2 min+2% NaClO 20 min對郁金香鱗片進行消毒的效果最佳，鱗片污染率為15%。郁金香組培研究[10-13]多選用0.1%HgCl2對外植體進行消毒，本文選用低毒的NaClO進行嘗試，且消毒效果較好，這為今后郁金香組培提供了一定技術(shù)參考。

本研究中不同層的鱗片誘導效果差異顯著。隨著由外向內(nèi)進行鱗片接種，其愈傷組織誘導率逐漸減小，而小鱗莖誘導率逐漸增大，這與胡新穎等[11]的研究結(jié)果趨勢相同，但誘導率遠高于其試驗結(jié)果。胡新穎等[11]研究表明，中層鱗片易誘導成愈傷組織，誘導率為8.0%；內(nèi)層鱗片較易直接誘導生芽，再生率達26.7%。本研究中，外層鱗片愈傷誘導率高達88.00%，內(nèi)層小鱗莖誘導率高達57.89%。進一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究中鱗莖取材時間是3月，此時正處于更新球膨大期，而胡新穎等[11]選自荷蘭進口種球，此期一般已完成花芽分化，這可能是二者誘導率不同的主要原因。因此，不同取材時期等因素對郁金香組織培養(yǎng)的影響也是接下來的研究重點。

本文中兩個不同時期取材得到的誘導效果有顯著差異。2019年3月27日田間郁金香處于更新球膨大期，該階段取材的更新球外面仍包著一層老鱗片，但老鱗片干皺不飽滿。2019年7月31日外植體取自收獲后的種球，這一時期郁金香鱗莖內(nèi)的花芽分化已經(jīng)完成。鱗莖膨大期的鱗片可直接誘導出愈傷組織和小鱗莖，花芽分花后期的鱗片可誘導出小鱗莖和綠葉組織，說明鱗莖的取材時間和發(fā)育狀態(tài)對小鱗莖的誘導結(jié)果不同。由此可見，外植體取材部位和取材時期的選擇可能是影響誘導出愈傷組織還是直接誘導小鱗莖的關鍵因素。

本試驗中選用帶有底盤的不同層鱗片作為外植體，內(nèi)層鱗片的基部可直接誘導出小鱗莖，誘導率高達73.33%。同時發(fā)現(xiàn)，有的鱗片可直接誘導出小鱗莖，而部分鱗片則同時誘導出小鱗莖和綠色葉片，該現(xiàn)象在其他文獻中未見報道。小鱗莖在6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基上顏色濃綠、生長健壯、數(shù)量增多，說明該配方比較適合小鱗莖的增殖。

對鱗片直接誘導產(chǎn)生的組織的稱呼多有不同，有稱為再生小鱗莖[10，13]、再生芽[11]或不定芽[12]。本文中發(fā)現(xiàn)由鱗片直接誘導出的該組織由底部膨大發(fā)白的鱗片和上部伸長呈綠色管狀的芽組成，該結(jié)構(gòu)與郁金香鱗莖基部外側(cè)長出來的小鱗莖極為相似，因此，本文稱其為小鱗莖。