任海英，程龍軍，胡丹，鄭錫良，張淑文，俞浙萍，戚行江

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.溫州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 溫州 325011)

楊梅(Myricarubra)是我國南方特色優(yōu)勢水果之一，為楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica)植物，果實甜酸適口，風(fēng)味獨特。截至2018年，我國楊梅種植面積約33.50萬hm2，其中，浙江省栽培楊梅8.90萬hm2，產(chǎn)量58.44萬t，年產(chǎn)值50多億元，楊梅是山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要樹種。許多楊梅產(chǎn)區(qū)，尤其是海拔高于500 m的地區(qū)，經(jīng)常持續(xù)低溫數(shù)天，導(dǎo)致楊梅樹葉片、新梢、樹干等受到嚴(yán)重凍害。楊梅適宜生長在年平均溫度15～21 ℃的地區(qū)，溫度低于-9 ℃超過48 h楊梅容易受到凍傷[1]。果園調(diào)查顯示，楊梅受凍的臨界溫度為-8～-10 ℃，幼齡樹比成年樹受凍害嚴(yán)重，遲熟品種比早熟品種受凍害嚴(yán)重[2-3]。篩選出適合高海拔地區(qū)栽培的楊梅耐凍品種是楊梅產(chǎn)業(yè)的迫切需求，但是目前未見楊梅抗低溫脅迫的理論研究，無法進行不同海拔和不同地區(qū)的果園品種規(guī)劃，以及低溫脅迫的預(yù)測預(yù)報和防控指導(dǎo)。

多種作物會受到低溫的脅迫傷害。低溫脅迫后柑橘葉片出現(xiàn)卷曲、失水、凍斑[4]。甘蔗植株受低溫脅迫后葉片干枯、卷曲，生長點損傷或壞死變黑，蔗莖側(cè)芽發(fā)黑、變軟，縱剖蔗莖可明顯看到莖內(nèi)組織呈水煮狀[5]。開花期低溫脅迫導(dǎo)致水稻花粉萌發(fā)率顯著下降，穎花的不育花粉率增加[6]。低溫顯著降低大豆單株粒重[7]。烏菜受低溫脅迫后凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均有不同程度下降[8]。

適宜的溫度是植物生存的必要條件之一，它參與調(diào)控植物的整個生長發(fā)育過程。植物在受到低溫脅迫時，多種生理生化過程與酶活性受到影響[9]。低溫顯著影響植物的細胞膜透性、活性氧保護酶活性、滲透性物質(zhì)含量等，如柑橘[4]、枇杷[10]、柚木[11]、葡萄[12]、山欖科果樹[13]等在受到低溫脅迫后，相對電導(dǎo)率(REC)、過氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白(SP)含量和可溶性糖(SS)含量等發(fā)生顯著變化，通過隸屬函數(shù)法綜合分析細胞膜透性、活性氧保護酶活性、滲透性物質(zhì)含量各生化指標(biāo)能較好地評價不同品種材料的抗寒能力。低溫還影響植物的糖代謝、碳代謝和一些次級代謝等，會使淀粉和其他代謝物的降解延遲，進而影響糖酵解和其他過程，使糖代謝相關(guān)基因的表達顯著增加[14-15]；脫氫酶和金屬硫蛋白、泛素蛋白、休眠相關(guān)蛋白、質(zhì)膜固有蛋白和RNA結(jié)合蛋白受低溫誘導(dǎo)表達[16]，產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物[17-18]。

本研究選擇2個生產(chǎn)上主栽品種東魁、荸薺種，和1個新選育早熟品種早佳，利用1年生楊梅容器苗，在人工氣候室內(nèi)進行低溫脅迫條件的模擬處理，觀察不同品種植株的表型變化，研究低溫脅迫下楊梅的生理生化響應(yīng)，并且采用隸屬函數(shù)法對不同楊梅品種進行抗寒性綜合評價，以期為楊梅的抗低溫育種、果園品種規(guī)劃和低溫脅迫機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為東魁、荸薺種、早佳等長勢一致的1年生盆栽楊梅嫁接苗。

1.2 處理設(shè)計

從2018年的12月至2019年的1月底進行低溫處理。每盆為1次重復(fù)，每個處理重復(fù)3次。將試驗材料全株帶盆放入海爾程控冰箱，分別進行6 ℃(對照組)、3 ℃、0 ℃、-3 ℃、-6 ℃、-9 ℃處理24 h；然后選擇成熟葉(去除主脈)迅速放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱備用，測定生理生化指標(biāo)。

低溫處理后將植株移出程控冰箱，置于露天(平均溫度6 ℃)，觀察1個月，然后調(diào)查植株凍傷級數(shù)。設(shè)植株無凍害為0級，有1個枝條死亡為1級，有2～3個枝條死亡為3級，有4～5個枝條死亡為5級，有6～7個枝條死亡為7級，有8條和以上枝條死亡為9級。凍害指數(shù)(IC)(%)=各凍害級數(shù)×該級植株數(shù)/調(diào)查總植株數(shù)×100。

1.3 測定方法

參照蔡慶生[19]的方法，采用DDS-310型電導(dǎo)儀法測定REC。

MAD含量采用丙二醛含量測定試劑盒(MDA-2-Y)(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，蘇州)，按照試劑盒使用說明測定。SOD活性采用超氧化物歧化酶試劑盒(SOD-2-Y)(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，蘇州)，按照試劑盒使用說明進行測定。SS含量采用蒽酮比色法[20]測定。SP含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司BCA法蛋白含量測定試劑盒(BCAP-2-Y)進行測定。

1.4 抗寒性綜合評價

應(yīng)用隸屬函數(shù)法[21]綜合評價3個品種的抗寒性。SOD、SP和SS采用的公式為X(μ)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)；REC和MDA采用的公式為X(μ)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。其中，Xij為某指標(biāo)的測定值，Xmax為對應(yīng)指標(biāo)的最大值，Xmin為對應(yīng)指標(biāo)的最小值，X(μ)為隸屬函數(shù)值。先根據(jù)公式分別計算出3個品種各項指標(biāo)的隸屬度，然后取各項指標(biāo)的算術(shù)平均值作為平均隸屬度，進行綜合排名，平均隸屬度大代表抗寒性強。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行計算和方差分析，顯著性分析采用LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對楊梅幼苗外部形態(tài)的影響

3個楊梅品種低溫受傷害的趨勢相同，輕則葉片黃化，重則出現(xiàn)枯斑或者葉片邊緣變紅，最后是葉片徹底干枯死亡。東魁對低溫最敏感，荸薺種和早佳相似。東魁在6 ℃處理時個別嫩葉發(fā)黃無凍傷現(xiàn)象，經(jīng)3 ℃處理葉片開始大量發(fā)黃并出現(xiàn)凍傷現(xiàn)象，隨溫度降低發(fā)黃程度逐漸加深，葉片受凍傷越來越嚴(yán)重，低于-6 ℃處理的葉片凍傷指數(shù)達到63.0，-9 ℃處理的凍傷指數(shù)達到100.0(表1，圖1)。荸薺種在6 ℃和3 ℃處理后葉片翠綠，0 ℃處理后少許葉片開始發(fā)黃并有凍傷，隨著處理溫度的降低發(fā)黃程度逐漸加深，-9 ℃處理后完全死亡，凍傷指數(shù)達到100.0。早佳在6 ℃處理下葉片翠綠，3 ℃處理后葉片有輕微泛黃，0 ℃處理后少許葉片開始發(fā)黃有凍傷，隨著溫度的降低受凍程度逐漸加重，但-9 ℃處理后葉片殘存少許綠色，凍傷指數(shù)達到92.6。由此可見，東魁楊梅幼苗在-3 ℃處理后即受到較嚴(yán)重凍害，而荸薺種和早佳在-6 ℃處理后受到較嚴(yán)重凍害，而且是不可逆的葉片壞死。

2.2 低溫脅迫對楊梅幼苗葉片相對電導(dǎo)率的影響

由圖2可知，3個楊梅品種的REC隨著處理溫度降低變化趨勢不同，東魁和早佳的REC在實驗溫度內(nèi)保持持續(xù)上升；而荸薺種-6 ℃處理下REC最大，隨后下降。在6 ℃至-3 ℃處理中，3個楊梅品種的REC變化趨勢一致，與6 ℃對照相比，差異不顯著。-6 ℃處理后，3個品種的REC差異顯著，與對照相比，荸薺種REC增大45.77百分點，達到峰值。東魁和早佳在-6 ℃處理下植株REC出現(xiàn)小幅增加，-9 ℃處理的植株REC大幅升高，與對照相比，分別增加37.4和26.88百分點。

表1 不同低溫處理后恢復(fù)培養(yǎng)30 d楊梅植株的凍害指數(shù)

A、B、C行分別為東魁、荸薺種、早佳品種。a、b、c、d、e、f分別為6、3、0、-3、-6、-9 ℃處理的楊梅幼苗。圖1 不同低溫處理后恢復(fù)培養(yǎng)30 d的楊梅植株凍害情況

這說明荸薺種經(jīng)-6 ℃處理后胞內(nèi)電解質(zhì)外滲嚴(yán)重，而東魁和早佳經(jīng)-9 ℃處理后胞內(nèi)電解質(zhì)外滲嚴(yán)重。

圖2 低溫脅迫對楊梅幼苗相對電導(dǎo)率的影響

2.3 低溫脅迫對楊梅幼苗丙二醛含量的影響

隨著處理溫度的降低，3個楊梅品種的MDA含量變化趨勢不一致，東魁和早佳呈現(xiàn)降—升—降的趨勢，而荸薺種則呈升—降趨勢，在整個實驗溫度范圍內(nèi)荸薺種和早佳MDA含量高于東魁；6～-6 ℃處理后，荸薺種MDA含量高于早佳，早佳MDA含量高于東魁(圖3)。與6 ℃對照相比，東魁的MDA含量在3～-3 ℃處理后下降，0 ℃和-3 ℃處理后顯著降低，分別降低15.48%和23.46%；而-6 ℃和-9 ℃處理后MDA含量與6 ℃對照相比顯著升高，分別升高26.18%和15.19%。與對照相比，荸薺種的MDA含量在其他溫度處理下均有升高，其中3 ℃、0 ℃和-6 ℃處理后顯著升高，增加范圍在14.36%～38.27%，3 ℃處理的MDA含量最高。與對照相比，早佳在3、0、-3 ℃處理后MDA含量降低，3 ℃和0 ℃處理的下降顯著，分別下降12.81%、11.5%；-6 ℃和9 ℃處理的MDA含量升高，其中-6 ℃處理的MDA含量最高，與對照相比增加14.1%。這說明，荸薺種受低溫脅迫時細胞膜脂過氧化程度高，而東魁和早佳在-3 ℃及以上溫度時膜脂過氧化程度輕，產(chǎn)生較少的MDA。

圖中數(shù)據(jù)以鮮重計。圖4～6同。圖3 低溫脅迫對楊梅幼苗丙二醛含量的影響

2.4 低溫脅迫對楊梅幼苗抗氧化酶活性的影響

隨著處理溫度的降低，3個楊梅品種的SOD活性變化趨勢不同，東魁呈升—降—升趨勢，荸薺種呈降—升—降趨勢，早佳總體保持下降趨勢。整個試驗溫度內(nèi)，早佳SOD活性均高于荸薺種；除-9 ℃處理外，早佳的SOD活性也均高于東魁(圖4)。6 ℃對照組中，3個品種SOD活性差異顯著，其中早佳SOD活性最高，顯著高于荸薺種和東魁；荸薺種次之，東魁最低。東魁各處理組的SOD活性均比對照顯著增加，比對照高出13.16%～37.6%，-3 ℃處理的SOD活性最大。荸薺種的SOD活性只有-6 ℃處理的植株比對照高10%，其他溫度處理的SOD活性均比對照低，其中0 ℃、-3 ℃和-9 ℃處理比對照顯著降低，低23%～34%。與對照相比，0 ℃和3 ℃處理的早佳植株SOD活性沒有顯著變化，-3 ℃時開始下降，-9 ℃處理的SOD活性最小。這說明早佳品種的SOD活性強于東魁和荸薺種，東魁品種SOD活性在低溫脅迫下增強；而荸薺種SOD活性在低溫脅迫下降低，受低溫脅迫影響較大。

圖4 低溫脅迫對楊梅幼苗SOD活性的影響

2.5 低溫脅迫對楊梅幼苗有機溶質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的影響

隨著處理溫度降低，3個品種楊梅幼苗的SP含量變化趨勢不一致，東魁和荸薺種呈升—降—升—降”趨勢，早佳呈升—降—升—降—升趨勢，且三者的峰值均不同(圖5)。整個試驗溫度范圍內(nèi)荸薺種的SP含量始終高于東魁；6 ℃、3 ℃和-3 ℃處理的早佳植株SP含量高于東魁和荸薺種。經(jīng)-6 ℃～3 ℃處理的東魁SP含量均顯著高于對照，高11.56%～34.21%；-9 ℃處理的植株與對照無顯著差異。在所有處理組中，荸薺種的SP含量均顯著高于對照，高15.62%～57.73%，且0 ℃處理的植株SP含量最高。經(jīng)3 ℃、0 ℃和-3 ℃處理的早佳植株SP含量高于對照，其中，-3 ℃和3 ℃處理的SP含量分別比對照組高42.63%和33.63%；-9 ℃和-6 ℃處理的SP含量顯著低于對照，分別比對照組低15.61%和26.49%。這說明荸薺種的SP保護能力持續(xù)高于東魁，6 ℃、3 ℃、-3 ℃處理的早佳植株SP的保護能力強于東魁和荸薺種。

圖5 低溫脅迫對楊梅幼苗可溶性蛋白含量的影響

低溫處理后3個品種楊梅幼苗的SS含量變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)先升后降趨勢，但是出現(xiàn)峰值的時間和變化幅度不一樣(圖6)。東魁幼苗在3 ℃處理后SS含量出現(xiàn)最高，比對照組高12.8百分點，其他處理組與對照沒有顯著差異。荸薺種在0 ℃處理后植株SS含量最大，0 ℃和3 ℃處理SS含量顯著高于對照，分別高16.57百分點和10.53百分點；溫度低于-3 ℃后，各處理的SS含量與對照無顯著差異。3、0、-3 ℃處理的早佳SS含量與對照差異不顯著，而經(jīng)-6 ℃和-9 ℃處理的SS含量顯著低于對照，分別低17.94和9.10百分點。

圖6 低溫脅迫對楊梅幼苗可溶性糖含量的影響

2.6 楊梅幼苗抗寒性綜合評價

應(yīng)用隸屬函數(shù)法對楊梅抗寒性生理指標(biāo)進行綜合分析，其中REC、MDA的隸屬函數(shù)值由反隸屬函數(shù)公式求得。東魁、荸薺種、早佳的平均隸屬度為0.482、0.520、0.576。由表2可知，不同品種抗寒性強弱順序為早佳>荸薺種>東魁。該結(jié)果與楊梅低溫脅迫的表型數(shù)據(jù)相吻合，說明隸屬函數(shù)法能客觀評價不同楊梅品種的抗寒性。

表2 低溫脅迫下3個品種楊梅各指標(biāo)隸屬函數(shù)值與抗寒性綜合評價

3 小結(jié)與討論

低溫脅迫是重要的非生物脅迫之一，影響植物的生長、繁育、產(chǎn)量、質(zhì)量與地理分布等。前人研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對植株表型有很大影響，植物受損的直接表現(xiàn)有萎蔫、葉片呈水漬狀、果實出現(xiàn)斑點、苗木變?nèi)酢⑸L遲緩、黃化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低和局部組織壞死等[22]。本文研究發(fā)現(xiàn)，楊梅幼苗受低溫脅迫后，癥狀較輕時葉片黃化，稍微嚴(yán)重時葉片出現(xiàn)枯斑或者葉片邊緣變紅，嚴(yán)重時葉片徹底干枯死亡，與前人報道一致。

低溫損害后植物體內(nèi)不斷積累活性氧自由基，引起膜脂過氧化。MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，引起相對電導(dǎo)率升高，REC的高低和MDA含量表明了細胞膜受損傷的程度，與耐寒性呈負相關(guān)；SOD和過氧化氫酶(CAT)等可消除活性氧自由基，減輕植物受到的氧化脅迫損害，與耐寒性呈正相關(guān)；SP和SS降低了滲透勢，減緩因低溫導(dǎo)致的細胞失水，一定程度上減輕了植物的低溫傷害，與抗寒性綜合評價呈正相關(guān)[11,22-25]。東魁和早佳楊梅的REC隨著溫度降低保持持續(xù)上升趨勢，這與其他植物相似[23,25]，但是荸薺種卻是先升后降，與前人報道不同。這說明不同楊梅品種在受低溫傷害臨界值時胞內(nèi)電解質(zhì)外滲不但受低溫影響，還受自身生理生化等其他因素的影響。

單一抗寒指標(biāo)不足以判斷植物對逆境的適應(yīng)能力，采用隸屬函數(shù)法進行綜合評價結(jié)果更為可靠[4-5,26]。在0 ℃、-2 ℃和-4 ℃處理24 h，隨著處理溫度降低，不同柑橘品種的MDA含量均呈現(xiàn)顯著降低趨勢，SS含量呈先升高后降低趨勢[4]。在0～-25 ℃低溫下脅迫2 h，6種木蘭科植物葉片SP含量和SOD活性呈先升高后降低的趨勢[26]。-12～-27 ℃低溫處理葡萄1年生枝條24 h，隨著處理溫度下降，所有處理葡萄枝條SS含量先上升后下降，SOD活性呈升高—降低—升高—降低的趨勢[12]。3～-5 ℃低溫處理24 h，隨處理溫度降低，各品種枇杷幼果種胚REC呈現(xiàn)小—大—小的S型變化曲線，6個枇杷品種的MDA含量隨低溫脅迫均呈現(xiàn)出先升高后降低的倒V型變化趨勢[10]。3個楊梅品種的MDA含量、SOD活性、SP和SS含量變化趨勢表現(xiàn)較為復(fù)雜，與木蘭、葡萄、枇杷和西番蓮等個別指標(biāo)類似。這些植物不同生理生化指標(biāo)的趨勢差異很可能是因為植物本身對溫度的敏感性不同，涉及低溫脅迫溫度不同引起的。在3～-3 ℃處理下，早佳和東魁的SOD活性較強，清除活性氧免受傷害的能力強于荸薺種，-3 ℃及以上溫度處理時膜脂過氧化程度輕，產(chǎn)生較少的MDA，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲少，這說明SOD活性對早佳和東魁的抗寒性很重要，但是荸薺種可能有其他作用更強的活性氧清除酶。荸薺種SP的保護能力持續(xù)高于東魁，這說明SP對荸薺種的抗寒性有較為重要的作用。當(dāng)溫度低于-3 ℃時，3個楊梅品種的SS含量都較低，這說明溫度過低SS失去了對楊梅的保護作用。采用REC、MDA、SOD、SP和SS的隸屬函數(shù)法評價3個楊梅的抗寒性結(jié)果與表型結(jié)果一致，因此，這5個指標(biāo)可以作為楊梅抗寒性評價的關(guān)鍵指標(biāo)。

噴施一些抗凍物質(zhì)可以調(diào)控植物受到低溫脅迫后的生理生化反應(yīng)，提高植物的抗寒性，如EBR(24-表油菜素內(nèi)酯)[27]、防凍劑[28]、生物刺激素PVE (paecilomyces variotiiextracts)[29]、外源一氧化氮(NO)供體硝普鈉(SNP)[30-31]和ABA[32]等。當(dāng)環(huán)境溫度低于3 ℃時，建議及時給楊梅噴施抗凍物質(zhì)，可能會有效減輕楊梅尤其是高山楊梅受到的低溫傷害。目前已有報道一些基因與功能蛋白參與植物的低溫脅迫[33-35]，但是研究尚不夠深入。今后應(yīng)挖掘誘導(dǎo)楊梅冷馴化和耐寒能力的關(guān)鍵基因，尤其是SS代謝相關(guān)的基因，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，有目的地提高楊梅的抗寒性，為耐寒性強楊梅種質(zhì)資源的良種選育與新品種創(chuàng)制提供基礎(chǔ)，擴大楊梅的栽培范圍。

本文研究結(jié)果說明楊梅的抗寒機制十分復(fù)雜，不能采用單一生理生化指標(biāo)進行抗寒性評價，隸屬函數(shù)法評價的抗寒性與低溫受害表型一致，說明REC、MDA、SOD、SP和SS可以作為綜合評價楊梅抗寒性的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究填補了楊梅抗寒性理論研究的空白，不足之處是未就參與低溫脅迫的關(guān)鍵基因和功能蛋白進行研究，未就增強楊梅抗凍性的物質(zhì)進行篩選。