王小愛 梁建東 高小嬌蔡遠俊 秦宇蒙 田維毅

(1. 貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學菌物藥研究中心，貴州 貴陽 550025)

細腳蟲草[Cordycepstenuipes(Peck) Kepler, B. Shrestha & Spatafora]為蟲草菌科蟲草菌屬，其同物異名包括高雄山蟲草(Cordycepstakaomontana)、細腳棒束孢(Isariatenuipes)、細腳擬青霉(Paecilomycestenuipes)[1]，在日本和韓國已被開發(fā)成保健食品[2]。多糖是細腳蟲草的主要生物活性成分之一[3]，具有抗腫瘤、抗抑郁、抗氧化、調節(jié)免疫等生物活性[4]。根據其存在位置可分為胞內多糖(從菌絲體或子實體中獲取)和胞外多糖(從發(fā)酵液中獲取)[5]。目前，國內外對于細腳蟲草多糖化學結構、抗腫瘤及免疫調節(jié)作用等已有相關報道[6-9]，但對細腳蟲草多糖提取工藝優(yōu)化方面報道較少，有學者[10]利用神經網絡—遺傳算法優(yōu)化細腳擬青霉胞內多糖超聲提取工藝，但多糖提取效率較低，最高僅有2.37%。而蟲草多糖常用的提取方法有水提醇沉法、超聲波輔助提取法和微波提取法等[11-12]，其中最常用的方法為水提醇沉法，具有操作簡單、成本低、對多糖的破壞性較小等優(yōu)點。

研究擬采用水提醇沉法提取細腳蟲草多糖，對蟲草多糖的發(fā)酵工藝、水提醇沉工藝及脫蛋白工藝進行優(yōu)化，以期為細腳蟲草有效成分的研究及開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

細腳蟲草：課題組分離自野外采集的標本，經鑒定后保藏在貴州中醫(yī)藥大學菌物藥研究中心，菌種號A1721。

1.1.2 試劑

葡萄糖：分析純，國家標準物質網；

硫酸：分析純，重慶川動化工集團有限公司；

苯酚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

考馬斯亮藍：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

牛血清蛋白：分析純，上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，純水1 000 mL；

種子培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，純水1 000 mL；

發(fā)酵產多糖培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖33.3 g，蛋白胨29.2 g，FeSO41.5 g，KH2PO41.5 g，純水1 000 mL，pH 6.0。

1.2 多糖培養(yǎng)及分離純化

1.2.1 種子液培養(yǎng) 取PDA斜面保藏菌種，PDA平板25 ℃活化培養(yǎng)4 d，以1 mL槍頭打孔，取5個菌餅至100 mL 種子培養(yǎng)基，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)4 d。

1.2.2 發(fā)酵產多糖培養(yǎng) 將種子液按2%接種量接入發(fā)酵產多糖培養(yǎng)基中，在25 ℃，200 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)7 d。

1.2.3 多糖分離 采用水提醇沉法[13-14]。發(fā)酵液在4 000 r/min 下離心15 min，離心后所得的菌絲體，干燥保存；上清液在4 ℃保存。將上清液濃縮，加入3倍體積的無水乙醇，于4 ℃醇沉24 h，所得沉淀物為胞外粗多糖；干燥的菌絲以料液比(m菌絲∶V水)為1∶30 (g/mL)，在70 ℃下水浴60 min，浸提2次。過濾，將濾液濃縮，加約3倍體積的無水乙醇，于4 ℃醇沉24 h，所得沉淀物即為胞內粗多糖。

1.2.4 脫蛋白 采用Sevage法[13-14]。分別量取發(fā)酵液和菌絲體浸提液30 mL于2個250 mL錐形瓶中。氯仿—正丁醇(預先配制成V氯仿∶V正丁醇=4∶1的混合液)溶液10 mL，置于錐形瓶中，振搖15 min，4 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液。再加入其體積約1/2的氯仿—正丁醇溶液，重復上述步驟兩次。

1.3 工藝優(yōu)化

1.3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

(1) 無機鹽離子：取5組種子培養(yǎng)基，分別加入0.15% 的KH2PO4、FeSO4、KCl、CaCl2及MgSO4發(fā)酵培養(yǎng)，其他條件同1.2.1，考察其對胞內外多糖含量的影響，確定液體發(fā)酵的最佳離子種類。

(2) 維生素：取4組種子培養(yǎng)基，分別添加0.1 g/L的維生素B1、維生素B2、復合維生素B、維生素C發(fā)酵培養(yǎng)，其他條件同1.2.1，考察其對胞內外多糖含量的影響，確定液體發(fā)酵的最佳維生素種類。

(3) Plackett-Burman(PB)試驗設計：綜合單因素試驗考察的結果，對細腳蟲草發(fā)酵的溫度、轉速、接種量、pH等8個試驗因素進行顯著性分析，每個因素設計高、低兩種水平(1，-1)，選擇蟲草多糖含量(OD值)為考察指標確定影響多糖產量的顯著因素。

(4) 最陡爬坡試驗：根據PB設計的結果，由各因素效應值的大小確定變化的步長。按一定的梯度增加或者減少各因素的水平值，檢測發(fā)酵液中多糖含量OD值為響應值，含量最高組的水平值即為響應面分析的中心組。

(5) Box-Behnken試驗設計：以PB設計篩選出的3個顯著因素作為試驗因素，最陡爬坡試驗篩選出的濃度作為中心點，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計[15]。

1.3.2 胞外多糖提取條件優(yōu)化

(1) 濃縮倍數：將細腳蟲草發(fā)酵液離心后，在上清液中加入3倍體積的無水乙醇，pH 7.0，4 ℃沉淀24 h，考察濃縮倍數(1，2，3，4，5)對胞外多糖提取率的影響。

(2) 沉淀乙醇倍數：將細腳蟲草發(fā)酵液離心后，將上清液濃縮，pH 7.0，4 ℃沉淀24 h，考察沉淀乙醇倍數(1，2，3，4，5)對胞外多糖提取率的影響。

(3) 沉淀時間：將細腳蟲草發(fā)酵液離心后，將上清液濃縮，加入3倍無水乙醇，pH 7.0，4 ℃沉淀，考察沉淀時間(6，12，18，24，30 h)對胞外多糖提取率的影響。

(4) 沉淀pH：將細腳蟲草發(fā)酵液離心后，將上清液濃縮，加入3倍無水乙醇，4 ℃沉淀24 h，考察沉淀pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0)對胞外多糖提取率的影響。

1.3.3 胞內多糖提取條件優(yōu)化

(1) 浸提比：70 ℃水浴60 min，浸提2次，過濾，將濾液濃縮，加3倍無水乙醇，4 ℃醇沉24 h，考察浸提比[m菌絲∶V水分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)]對胞內多糖提取率的影響。

(2) 浸提時間：70 ℃水浴按浸提比(m菌絲∶V水)為1∶40 (g/mL)浸提2次，將濾液濃縮，加3倍無水乙醇，4 ℃ 醇沉24 h，考察浸提時間(30，60，90，120，150 min)對胞內多糖提取率的影響。

(3) 浸提溫度：浸提比(m菌絲∶V水)為1∶40 (g/mL)下水浴90 min，浸提2次，將濾液濃縮，加3倍無水乙醇，4 ℃ 醇沉24 h，考察浸提溫度(60，70，80，90，100 ℃)對胞內多糖提取率的影響。

(4) 浸提次數：在70 ℃下按浸提比(m菌絲∶V水)為1∶40 (g/mL)水浴90 min，將濾液濃縮，加3倍無水乙醇，4 ℃醇沉24 h，考察浸提次數(1，2，3，4，5)對胞內多糖提取率的影響。

1.3.4 脫蛋白條件優(yōu)化

(1) Sevage試劑與發(fā)酵液配比：取適量多糖溶液，加入Sevage試劑(氯仿與正丁醇的混合液，V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，振搖15 min，4 000 r/min 離心10 min，棄沉淀，取上清液，重復操作3次，考察Sevage試劑與發(fā)酵液配比(VSevage試劑∶V發(fā)酵液分別為1∶4,1∶3，1∶2，1∶1，2∶1)對多糖蛋白脫除率的影響。

(2) 氯仿與正丁醇配比：在Sevage試劑與發(fā)酵液(VSevage試劑∶V發(fā)酵液)為1∶2，振搖15 min，4 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液，重復操作3次，考察氯仿與正丁醇配比(V氯仿∶V正丁醇分別為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)對多糖蛋白脫除率的影響。

(3) 振搖時間：在Sevage試劑與發(fā)酵液(VSevage試劑∶V發(fā)酵液)為1∶2，氯仿與正丁醇配比(V氯仿∶V正丁醇)為4∶1，4 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液，重復操作3次，考察振搖時間(5，10，15，20，25 min)對多糖蛋白脫除率的影響。

(4) 脫蛋白次數：在Sevage試劑與發(fā)酵液(VSevage試劑∶V發(fā)酵液)為1∶2，氯仿與正丁醇配比(V氯仿∶V正丁醇)為4∶1，振搖15 min，4 000 r/min 離心10 min，棄沉淀，取上清液，考察脫蛋白次數(1，2，3，4，5)對多糖蛋白脫除率的影響。

1.4 測定方法

1.4.1 多糖含量測定 采用苯酚硫酸法[16]。葡萄糖標準品繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=7.74X+0.014 6，R2=0.999 2。結果表明，葡萄糖標準品濃度在0.02～0.10 mg/mL 范圍內線性關系良好。

1.4.2 蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍比色法[17]。牛血清蛋白標準品繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=4.86X+0.074 2，R2=0.998 3。結果表明，牛血清蛋白標準品濃度在0.02～0.10 mg/mL范圍內線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 無機鹽離子篩選 由圖1可知，添加無機鹽試驗組的多糖含量均有不同程度的增加，其中添加FeSO4的胞內外多糖含量相對較高。因此，發(fā)酵多糖時培養(yǎng)基組分加入FeSO4。

2.1.2 維生素種類篩選 由圖2可知，選取不同的維生素為生長因子發(fā)酵多糖，多糖含量無明顯變化。因此，后續(xù)試驗不添加維生素。

2.1.3 PB試驗 對細腳蟲草發(fā)酵的溫度、轉速、接種量、pH等8個試驗因素的水平取值見表1，試驗結果見表2，顯著性分析見表3。

由表3可知，接種量、葡萄糖、蛋白胨的效應顯著。因此，確定接種量、葡萄糖、蛋白胨是影響多糖產量的顯著因素。

圖1 無機鹽離子對細腳蟲草產多糖的影響

圖2 維生素對細腳蟲草產多糖的影響

表1 PB試驗設計

表2 PB試驗結果

2.1.4 最陡爬坡試驗 根據PB試驗結果，設計顯著因素的步長，試驗設計及結果見表4。由表4可知，2號試驗所對應的多糖產量最大，因此以2號試驗的條件為響應面試驗因素水平的中心點，設計Box-Behnken試驗。

2.1.5 Box-Behnken試驗 Box-Behnken試驗設計見表5，試驗結果見表6。運用Design-Expert 8.0.5軟件對表6 的試驗結果進行回歸分析，得到多元回歸擬合方程：

表3 PB試驗顯著性分析?

表4 最陡爬坡試驗設計與結果?

Y=0.663+0.011X1+1.500E-003X2-4.125E-對其進行方差分析，結果見表7。

表5 Box-Behnken試驗設計

表6 Box-Behnken試驗結果

(1)

通過數據分析得出，細腳蟲草的最佳產多糖條件為培養(yǎng)溫度25 ℃，黑暗，搖床轉速200 r/min，葡萄糖添加量33.3 g/L，蛋白胨添加量29.2 g/L，接種量3.9%，FeSO4添加量1.5 g，KH2PO4添加量1.5 g，pH 6.0，培養(yǎng)時間7 d。此條件下胞外多糖產量為13.74 mg/mL，較優(yōu)化前的胞外多糖產量(9.87 mg/mL)提高了28.16%；胞內多糖產量為63.48 mg/g，較優(yōu)化前的胞內多糖產量(56.29 mg/g)提高了11.33%。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 胞外多糖提取工藝優(yōu)化 由圖3可知，多糖沉淀隨醇濃度升高而增多，醇沉時間越長多糖得率越高。確定胞外多糖提取工藝條件為：濃縮、加3倍乙醇，沉淀24 h，pH 6.0。在此條件下，胞外多糖產量為15.89 mg/mL，較優(yōu)化前的胞外多糖產量(13.74 mg/mL)提高了13.53%。

2.2.2 胞內多糖提取工藝優(yōu)化 由圖4可知，浸提比(m菌絲∶V水)為1∶40 (g/mL)時多糖提取率最大，在一定范圍內增加浸提液的體積可以增大與浸提物的接觸面積，提高水溶性多糖的溶出量；浸提90 min時多糖提取率最大，提取初期，多糖能夠隨時間增長不斷浸出，但時間過長多糖浸出量很難增加，甚至使多糖降解；浸提溫度為80 ℃時多糖提取率最大，多糖的溶解度在一定范圍內隨溫度的升高而增大，由于多糖的熱不穩(wěn)定性當溫度繼續(xù)升高可能會分解多糖得率反而下降；浸提初期浸出量比較高，在反復浸提時菌絲內多糖的含量較少。確定胞內提取多糖條件為浸提比(m菌絲∶V水)1∶40 (g/mL)，提取時間90 min，浸提溫度80 ℃，浸提次數2次。在此條件下，胞內多糖產量為74.65 mg/g，較優(yōu)化前的胞內多糖產量(63.48 mg/g) 提高了14.96%。

2.3 Sevage法純化多糖工藝優(yōu)化

2.3.1 Sevage試劑與發(fā)酵液配比對脫蛋白效果的影響

由圖5可知，蛋白脫除率和多糖損失率隨著Sevage試劑加入量的增加均呈不同程度的遞增趨勢，在Sevage試劑與發(fā)酵液配比(VSevage試劑∶V發(fā)酵液)在1∶2后蛋白質脫除率及多糖損失率趨于平衡。因此，確定Sevage試劑與發(fā)酵液配比(VSevage試劑∶V發(fā)酵液)為1∶2。

2.3.2 氯仿與正丁醇配比對脫蛋白效果的影響 由圖6可知，蛋白脫除率隨氯仿用量上升而增大，氯仿與正丁醇配比(V氯仿∶V正丁醇)在4∶1后蛋白質脫除率及多糖損失率趨于平衡。氯仿是引起蛋白變性的主要原因，蛋白脫除率隨氯仿加入量增高而升高；正丁醇會使多糖溶解，加入量越少，糖損失率越低。因此，確定氯仿與正丁醇配比(V氯仿∶V正丁醇)為4∶1。

表7 回歸方程方差分析?

圖3 不同因素對胞外多糖提取率的影響

圖4 不同因素對胞內多糖提取率的影響

2.3.3 振搖時間對脫蛋白效果的影響 由圖7可知，隨著振搖時間的增加，脫蛋白率呈上升趨勢，振搖時間越長，多糖溶液與Sevage試劑充分接觸，使蛋白脫除率升高，在15 min時達到最大值，之后基本不變。因此，確定振搖時間為15 min。

2.3.4 脫蛋白次數對脫蛋白效果的影響 由圖8可知，隨著脫蛋白次數增加，脫蛋白率呈上升趨勢，多糖溶液在脫蛋白初期蛋白脫除率比較高，在反復脫除時多糖內蛋白含量減少，在第3次后基本趨于平衡。因此，確定脫蛋白次數為3次。

圖5 Sevage試劑與發(fā)酵液配比對脫蛋白效果的影響

圖6 氯仿與正丁醇配比對脫蛋白效果的影響

圖7 振搖時間對脫蛋白效果的影響

3 結論

采用單因素及響應面試驗對細腳蟲草多糖發(fā)酵提取及用Sevage法純化多糖條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化發(fā)酵條件及提取條件后，胞外多糖得率提高了37.89%，胞內多糖得率提高了24.59%。Sevage法胞內外多糖蛋白的脫除率均高于75%，具有良好的去雜純化效果且多糖損失較小。后期可采用超聲輔助提取、微波提取等方法進一步減少提取時間，提高提取效率；可以考慮用玉米粉、黃豆粉代替蛋白胨，以降低原料成本。此外，Sevage法脫蛋白雖具有較好的效果，但存在安全隱患，后續(xù)可以尋求酶法、吸附法等脫蛋白工藝。

圖8 脫蛋白次數對脫蛋白效果的影響