李少?gòu)?qiáng) 耿俊嫻 李艷萍 劉雄波 彭曉 屈軍樂 劉麗煒 胡睿

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院， 教育部/廣東省光電子器件與系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 深圳 518060)

多光子成像技術(shù)由于具有低侵入性、強(qiáng)穿透力、高空間分辨率等優(yōu)點(diǎn)， 自問世以來便成為生物醫(yī)學(xué)研究的有力工具， 在癌癥病理、神經(jīng)疾病及腦功能成像等方面取得了一系列較好的研究成果. 目前， 應(yīng)用較為廣泛的多光子成像技術(shù)是雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)， 其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有較大的發(fā)展?jié)摿? 本文詳細(xì)闡述了多光子成像技術(shù)在多色成像、功能成像及成像深度等方面的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用新進(jìn)展， 包括多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像、雙光子激發(fā)熒光壽命顯微成像、雙光子光纖內(nèi)窺成像和三光子顯微成像技術(shù)， 并簡(jiǎn)要介紹這幾種多光子成像技術(shù)的原理與特性， 最后展望其未來發(fā)展前景.

1 引 言

多光子激發(fā)是指在具有高光子密度的入射光激發(fā)下， 處于基態(tài)的分子/原子同時(shí)吸收多個(gè)光子后躍遷到激發(fā)態(tài)， 經(jīng)過弛豫過程躍遷到亞激發(fā)態(tài)，最后自發(fā)輻射回到基態(tài)， 釋放出頻率略小于多倍入射光頻率的熒光光子[1]. 1990 年Denk 等[2]開發(fā)了第一臺(tái)雙光子激光掃描顯微鏡后， 多光子成像就以其低侵入性、高穿透性、高空間分辨率等優(yōu)勢(shì)走進(jìn)人們的視野. 目前最常見的多光子成像技術(shù)是雙光子激發(fā)熒光(two-photon excited fluorescence，2PEF)和三光子激發(fā)熒光(three-photon excited fluorescence， 3PEF)成像， 它們對(duì)應(yīng)的能級(jí)圖如圖1 所示.

相較于單光子激發(fā)熒光、激光掃描共聚焦和寬場(chǎng)成像等技術(shù)， 多光子成像技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)多光子成像技術(shù)通常采用的激發(fā)光為波長(zhǎng)較長(zhǎng)的近紅外光， 相比可見光， 近紅外光在生物組織中的穿透能力更強(qiáng)， 能夠觀察到生物組織中更深層的信息， 侵入性較低； 2)多光子成像只有在激發(fā)光焦點(diǎn)附近的區(qū)域才能激發(fā)熒光， 因此多光子成像技術(shù)具有天然的光學(xué)層析能力， 能更好地對(duì)生物組織進(jìn)行三維成像； 3)多光子成像在樣品的非焦點(diǎn)區(qū)域不產(chǎn)生熒光， 能自動(dòng)抑制離焦信號(hào)， 因而相比寬場(chǎng)成像技術(shù)， 多光子成像能實(shí)現(xiàn)近乎衍射極限的空間分辨率， 因此能觀察到組織內(nèi)更細(xì)微的結(jié)構(gòu)； 4)與共聚焦成像技術(shù)相比， 多光子成像技術(shù)不需要使用針孔濾波， 熒光收集效率高.

圖1 2PEF、3PEF 過程能級(jí)圖. 2PEF 和3PEF 都是非直接激發(fā)輻射過程， 存在非輻射能量轉(zhuǎn)移. 圖中 νp 為吸收光子頻率， νf 為發(fā)射熒光頻率， ν NR 為非輻 射能量轉(zhuǎn)移.Fig. 1. Energy level diagram of 2PEF and 3PEF process.Both 2PEF and 3PEF are indirect excitation radiation processes， and there is non-radiative energy transfer. In the figure， νp is the frequency of absorbed photons， νf is the frequency of emitted fluorescence， and ν NR is the non-radiative energy transfer.

2PEF 是目前最常見的多光子成像技術(shù)， 因其具有如上優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域， 其對(duì)系統(tǒng)要求較簡(jiǎn)單， 許多活體內(nèi)源性熒光團(tuán)或光學(xué)探針都具有雙光子吸收效應(yīng)， 能進(jìn)行雙光子激發(fā)熒光顯微成像. 而且2PEF 容易與其他光學(xué)手段如熒光壽命顯微成像技術(shù)、光纖內(nèi)窺成像技術(shù)、光片技術(shù)等結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)樣品信息更多維度信息或更高的成像指標(biāo). 但其在應(yīng)用時(shí)也存有缺陷， 致使其在多色成像、功能成像、成像深度等方面仍面臨著巨大挑戰(zhàn).例如， 利用2PEF 研究含有多種熒光團(tuán)的樣品時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)多種熒光團(tuán)的同時(shí)最優(yōu)激發(fā). 而多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像通過增加激光器或采用連續(xù)光譜的方法， 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多色標(biāo)記的細(xì)胞或蛋白質(zhì)的同時(shí)成像和動(dòng)態(tài)追蹤. 另外， 2PEF 雖然能對(duì)樣品進(jìn)行高分辨率成像， 但其獲得的僅僅是熒光強(qiáng)度信號(hào)， 信息維度有限， 雙光子激發(fā)熒光壽命顯微成像通過探測(cè)熒光壽命信息， 可以在進(jìn)行高分辨三維成像的同時(shí)獲取生物組織的生化特性信息. 此外，2PEF 在生物醫(yī)學(xué)成像的應(yīng)用常局限在細(xì)胞、離體樣品或者活體表層， 難以進(jìn)行體內(nèi)深層器官組織成像， 雙光子光纖內(nèi)窺成像通過減小系統(tǒng)尺寸， 能將成像延伸到活體內(nèi)深處組織， 提供了低侵入性的解決方案. 在進(jìn)行活體腦功能成像時(shí)， 2PEF 雖然可以通過增加波長(zhǎng)來減少組織散射， 但最終成像深度受限于信號(hào)背景比為1 的條件[3]， 而三光子顯微成像技術(shù)通過將波長(zhǎng)拓展到1600 nm 到1820 nm，在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)激發(fā)光的衰減最小， 由此在活體腦成像時(shí)能獲得更高的成像深度和信噪比. 可見， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像、雙光子光纖內(nèi)窺成像、雙光子激發(fā)熒光壽命顯微成像和三光子顯微成像技術(shù)這幾種多光子成像技術(shù)能大大拓寬傳統(tǒng)2PEF 的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用范圍， 具有極大的發(fā)展?jié)摿?本文簡(jiǎn)要介紹了這幾種多光子成像技術(shù)的成像原理及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用， 最后對(duì)其未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望.

2 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像

監(jiān)測(cè)人體微環(huán)境中細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA 等動(dòng)態(tài)特性和相互作用， 對(duì)于活體成像和免疫治療等研究具有重大意義. 多色熒光顯微成像使用具有不同發(fā)射光譜的熒光團(tuán)標(biāo)記不同的細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA等， 通過熒光團(tuán)的光譜信息區(qū)分標(biāo)記樣品的類型和功能， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種標(biāo)記物的動(dòng)態(tài)追蹤[4]. 在共聚焦成像中， 單光子多色成像通常采用一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)多種標(biāo)記物， 但是由于熒光團(tuán)的單光子激發(fā)光譜較窄， 不同熒光團(tuán)的激發(fā)光譜可能相差很大， 所以一個(gè)波長(zhǎng)難以激發(fā)多種熒光團(tuán)[5]. 相比之下， 常見的熒光團(tuán)的雙光子激發(fā)光譜更寬[6]， 不同熒光團(tuán)激發(fā)光譜重疊可能性大， 故多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像更容易實(shí)現(xiàn). 圖2 所示為典型的激光掃描多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像系統(tǒng).

針對(duì)多色標(biāo)記熒光團(tuán)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)， 需要同時(shí)有效地激發(fā)多色熒光標(biāo)記物， 并且在成像時(shí)快速區(qū)分熒光標(biāo)記物所標(biāo)記的細(xì)胞、細(xì)胞器或蛋白質(zhì)等. 由于許多熒光物質(zhì)的雙光子吸收光譜較單光子吸收光譜要寬， 光譜重疊較高， 所以用單一波長(zhǎng)的光源也可以同時(shí)激發(fā)多種熒光團(tuán)， 實(shí)現(xiàn)多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像， 但熒光團(tuán)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)往往不一致， 單一波長(zhǎng)的光源無法實(shí)現(xiàn)最優(yōu)激發(fā)， 且當(dāng)熒光團(tuán)本身雙光子吸收截面較小時(shí)， 為了獲取多種熒光團(tuán)的熒光信號(hào)， 往往需要增加功率來提高熒光強(qiáng)度， 這會(huì)引起光毒性和產(chǎn)生光漂白效應(yīng). 此外，增加激光功率也會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性自發(fā)熒光， 其與所用熒光團(tuán)發(fā)射的熒光可能存在光譜重疊現(xiàn)象，這種光譜串?dāng)_會(huì)影響對(duì)于標(biāo)記細(xì)胞或蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè).

圖2 激光掃描多色雙光子激發(fā)熒光顯微鏡系統(tǒng)示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； Optical isolator， 光隔離器； Mirror， 反射鏡； HWP (half-wave plate)， 半波片； Lens， 透鏡； PCF (photonic crystal fiber)， 光子晶體光纖； FL (fiber launcher)， 光纖耦合器； Filter， 濾光片； Scanners， 掃描振鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測(cè)器； Monochromator， 單色儀； Obj (objective)， 物鏡Fig. 2. Schematic diagram of laser scanning multicolor two-photon fluorescence microscope system. The abbreviations in the figure are as follows： HWP， half-wave plate； PCF， photonic crystal fiber； FL， fiber launcher； DM， dichroic mirror； PMT， photomultiplier tube； Obj， objective.

為了實(shí)現(xiàn)多種熒光團(tuán)的同時(shí)最優(yōu)激發(fā)， 提升多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像的信號(hào)強(qiáng)度， 可以采用多個(gè)波長(zhǎng)或?qū)拵Ч庾V的激發(fā)光源. 前一種方法的實(shí)現(xiàn)可以采用兩個(gè)或兩個(gè)以上的飛秒激光器作為多波長(zhǎng)激發(fā)光源[7]， 或采用拓展激發(fā)光的光譜波段的方法， 如光參量振蕩器(optical parametric oscillator，OPO)[8]. 利用鈦藍(lán)寶石振蕩器作為抽運(yùn)源， 可以使OPO 輸出1200 nm 以上的近紅外波段范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)諧的超短脈沖激光. 然而， 增加光源的成本很高， 成像光路也會(huì)由此變得復(fù)雜， 限制了這種多激勵(lì)源技術(shù)在多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像上的應(yīng)用. 后一種方法是利用寬帶可壓縮的連續(xù)光譜脈沖來實(shí)現(xiàn)多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像， 主要包括兩種： sub-20 fs 激光器發(fā)射的寬譜脈沖[9]和基于100 fs 激光器產(chǎn)生的光纖連續(xù)光譜[10]. sub-20 fs 激光器產(chǎn)生的短脈沖具有100 nm 以上相位穩(wěn)定的光譜帶寬. 通過脈沖整形引入的相位函數(shù)改變?cè)撁}沖光譜的相位相干性， 從而改變脈沖頻率， 進(jìn)一步提升熒光團(tuán)的雙光子激發(fā)效率， 實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)熒光團(tuán)的選擇性激發(fā). 該方法無需調(diào)節(jié)光路來選擇激發(fā)波長(zhǎng)， 但系統(tǒng)同樣復(fù)雜， 且需要特定的激光器. 而采用光纖產(chǎn)生超連續(xù)光來實(shí)現(xiàn)多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像則只需常用的100 fs 激光器， 其原理是利用激光器的飛秒脈沖在光纖中的非線性傳輸特性，結(jié)合脈沖壓縮技術(shù)產(chǎn)生寬帶光譜、短脈寬的飛秒脈沖. 該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)多色雙光子熒光團(tuán)的最優(yōu)激發(fā)， 還能顯著提升雙光子激發(fā)熒光的效率. 早期的連續(xù)光譜是用激光在普通單模光纖的正常色散區(qū)傳輸產(chǎn)生的[11]， 但光源系統(tǒng)十分復(fù)雜. 而目前人們則采用具有零色散點(diǎn)的光子晶體光纖(photonic crystal fiber， PCF)來產(chǎn)生連續(xù)光譜. 利用孤子效應(yīng)可以產(chǎn)生較寬光譜范圍的連續(xù)光譜， 且選擇合適的PCF 的參數(shù)可有效控制零色散點(diǎn)的位置. 但由于孤子效應(yīng)通常發(fā)生在PCF 的反常色散區(qū)， 因而其產(chǎn)生的連續(xù)光譜對(duì)振動(dòng)和噪聲十分敏感， 即使是很微弱的振動(dòng)也會(huì)使光譜結(jié)構(gòu)發(fā)生極大變化， 光譜相干性劇烈下降. 因此， 設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單的系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)多種熒光團(tuán)的同時(shí)最優(yōu)波長(zhǎng)激發(fā)， 同時(shí)在一定程度上保證雙光子激發(fā)效率和避免光譜串?dāng)_問題， 仍是多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)發(fā)展的重要方向.

多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)在癌癥診斷方面發(fā)揮著重要作用. 在早期的疾病診斷與病理學(xué)研究中， Li 等[12]通過采用PCF 產(chǎn)生波長(zhǎng)范圍為600—700 nm 的連續(xù)光譜激發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性熒光，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的NADH 和色氨酸成像. 以色氨酸的熒光作為參考， 對(duì)比色氨酸與NADH 兩者的信號(hào)強(qiáng)度， 從而實(shí)現(xiàn)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的區(qū)分， 繼而通過研究細(xì)胞代謝活性與蛋白質(zhì)的表達(dá)， 實(shí)現(xiàn)非侵入性癌癥診斷. 此后， Li 等[13]還使用OPO 技術(shù)來獲得超短飛秒脈沖， 在600 nm 波段進(jìn)行雙光子激發(fā)，并通過對(duì)NADH， FAD 和色氨酸的多色雙光子熒光成像， 成功地檢測(cè)了皮膚癌癥炎癥. Le Dévédec等[14]采用多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)基因表達(dá)， 利用小鼠模型研究了乳腺癌細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)移行為. 其結(jié)果證明了該系統(tǒng)可用于研究個(gè)體候選轉(zhuǎn)移基因在體內(nèi)外的作用， 并在研究癌癥轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞事件也可發(fā)揮作用. Entenberg 等[15]利用兩個(gè)鈦藍(lán)寶石激光器， 對(duì)用CFP， EGFP， TagRFP657等熒光蛋白標(biāo)記的小鼠乳腺癌腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)多色雙光子熒光成像. Piatkevich 等[16]開發(fā)了兩種紅色熒光蛋白LSS-mKate1 和LSS-mKate2， 它們具有較大的斯托克斯位移， 激發(fā)/發(fā)射最大值分別在463/624 nm 和460/605 nm. 通過將這些熒光蛋白應(yīng)用于乳腺癌的小鼠異種移植模型進(jìn)行多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像， 該小組觀察到乳腺癌細(xì)胞在活體小鼠血管中顯示出明顯的極化作用， 其成像結(jié)果如圖3 所示.

圖3 NLS-LSS-mKate1 標(biāo)記細(xì)胞核(紅色)和GalT-ECFP標(biāo)記高爾基(藍(lán)色)的腫瘤細(xì)胞的多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像[16]. 比例尺： 10 μmFig. 3. Multicolor two-photon excited fluorescence microimaging of tumor cells with NLS-LSS-mKate1 labeled nucleus (red) and GalT-ECFP labeled Golgi (blue)[16]. Scale bar： 10 μm.

如今， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像已被越來越多地應(yīng)用到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究中， 可實(shí)現(xiàn)在亞細(xì)胞水平記錄生命活動(dòng)信息. Collot 等[17]開發(fā)了用于細(xì)胞和組織中脂質(zhì)滴的多色成像的超亮熒光探針， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠肝臟的多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像. Garaschuk 等[18]通過在小鼠腦內(nèi)注射多種染料混合物并進(jìn)行多色成像， 可得到小鼠大腦表面500 μm 處不同神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的成像， 該方法適用于不同物種的各個(gè)發(fā)育階段腦組織染色，還能對(duì)進(jìn)行活體實(shí)時(shí)鈣信號(hào)記錄. Hayakawa 等[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+濃度超過15 μmol/L時(shí)會(huì)立即誘導(dǎo)線粒體去極化， 這個(gè)過程與線粒體中NADH 的氧化有關(guān). 通過采用多色雙光子顯微成像來表征單個(gè)神經(jīng)元中的線粒體反應(yīng)， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠神經(jīng)元中的單個(gè)線粒體的多色熒光顯微成像，證明了哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)元中線粒體去極化介導(dǎo)的快速的Ca2+依賴性的氧消耗. Mahou 等[20]利用飛秒激光器與OPO 產(chǎn)生的同步脈沖， 實(shí)現(xiàn)了具有不同吸收光譜的3 個(gè)熒光團(tuán)的多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像. 利用熒光團(tuán)來標(biāo)記細(xì)胞， 實(shí)現(xiàn)了小鼠腦組織的實(shí)時(shí)多色成像及果蠅胚胎中的多色熒光與三次諧波成像. 2014 年， Mahou 等[21]又將先前的工作進(jìn)行了拓展， 將雙光子光片照明與混合波長(zhǎng)激發(fā)相結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)了用28 MHz 像素速率來記錄斑馬魚胚胎中跳動(dòng)心臟的四維多色熒光顯微成像， 且光漂白幾乎忽略不計(jì). 2017 年， 該團(tuán)隊(duì)利用波長(zhǎng)混合(wavelength mixing)技術(shù)， 對(duì)NADH 和FAD這兩種內(nèi)源性熒光團(tuán)實(shí)現(xiàn)高效雙色雙光子成像， 同時(shí)結(jié)合雙光子激發(fā)熒光壽命成像技術(shù)對(duì)人皮膚和線蟲中NADH 和FAD 的壽命梯度進(jìn)行重建[22]. 隨后，2019 年， 該團(tuán)隊(duì)又提出彩色多光子串行顯微鏡(chromatic multiphoton serial microscopy， ChroMS)[23]，

通過波長(zhǎng)混合技術(shù)將三色雙光子激發(fā)與自動(dòng)連續(xù)組織切片結(jié)合， 能達(dá)到微米級(jí)分辨率的多色成像效果， 由此還實(shí)現(xiàn)了小鼠腦內(nèi)的三維多色成像. 圖4展示了用ChroMS 對(duì)小鼠皮層組織進(jìn)行連續(xù)三維成像的結(jié)果.

隨著熒光探針和激光光源技術(shù)的不斷發(fā)展， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)也在生物醫(yī)學(xué)中得到越來越多的應(yīng)用. 而與其他光學(xué)成像技術(shù)的結(jié)合， 如光片顯微技術(shù)、熒光壽命成像顯微技術(shù)(fluorescence lifetime imaging microscopy， FLIM)等，能不斷拓寬多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)的功能及應(yīng)用領(lǐng)域. 未來隨著超短脈沖激光器和信號(hào)探測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)將會(huì)具有更好的應(yīng)用前景.

3 雙光子激發(fā)熒光壽命成像

熒光壽命是指當(dāng)組成物質(zhì)的分子在受到光脈沖的激發(fā)躍遷到高能級(jí)后， 回到基態(tài)前在激發(fā)態(tài)的平均停留時(shí)間， 大約為ns 量級(jí)， 常用τ表示[24]. 熒光壽命是熒光物質(zhì)的自身屬性， 通常與激光的激發(fā)強(qiáng)度、光照時(shí)間和染料濃度等因素?zé)o關(guān)， 而與物質(zhì)自身所處微環(huán)境及其本身的結(jié)構(gòu)等條件有關(guān). 由于熒光壽命是熒光分子的固有性質(zhì)， FLIM 技術(shù)可以提供比強(qiáng)度、光譜更清晰的熒光染料標(biāo)記， 并且它包含關(guān)于熒光標(biāo)記的局部分子環(huán)境和發(fā)色團(tuán)光物理學(xué)的信息， 因此， FLIM 技術(shù)在成像時(shí)具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)， 能增強(qiáng)生物樣品的圖像對(duì)比度， 而且還可以獲取熒光分子所在的微環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物信息. 該技術(shù)目前已成為生物學(xué)、生物物理學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中研究樣品生化性質(zhì)的有力工具.

圖4 小鼠皮層組織的連續(xù)三維多色成像[23]Fig. 4. Continuous three-dimensional multicolor imaging of mouse cortical tissue[23].

測(cè)量熒光壽命的方法主要包括頻域法和時(shí)域法[25]. 頻域法又稱相位調(diào)制法， 主要有外差法和零差法. 如圖5(a)所示， 它利用強(qiáng)度按正弦規(guī)律調(diào)制的激光激發(fā)樣品， 從而使得樣品發(fā)出的熒光強(qiáng)度也具有相同的正弦調(diào)制頻率. 通過測(cè)量熒光和激發(fā)光之間的解調(diào)系數(shù)及兩者之間的相位差Δφ后可以計(jì)算得到熒光壽命值. 而時(shí)域法， 也稱作脈沖法， 主要有時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法(time-correlated single photon counting， TCSPC)、門控探測(cè)法(timegated detection)和條紋相機(jī)測(cè)量法(streak camera)3 種實(shí)現(xiàn)方式. 時(shí)域法測(cè)量熒光壽命的方法是利用超短脈沖光源來激發(fā)被測(cè)樣品， 以測(cè)量出樣品熒光強(qiáng)度的時(shí)間衰減規(guī)律， 再通過計(jì)算或擬合得到壽命[26]. TCSPC 是目前測(cè)量熒光壽命最常用的方法，如圖5(b)所示， 其原理是通過記錄激發(fā)脈沖過后首個(gè)熒光光子到達(dá)探測(cè)器的時(shí)間， 并記錄到對(duì)應(yīng)的時(shí)間通道中， 多次重復(fù)建立一個(gè)正比于熒光衰減曲線的光子數(shù)-時(shí)間分布直方圖. 常見的頻域法及TCSPC 法測(cè)量熒光壽命的原理及雙光子TCSPC-FLIM成像系統(tǒng)如圖5 所示.

雙光子FLIM 是將雙光子成像技術(shù)與FLIM技術(shù)的結(jié)合， 可獲取生物組織的生化特性信息， 同時(shí)進(jìn)行高分辨三維成像， 實(shí)現(xiàn)功能和結(jié)構(gòu)的精確定量表征. 兩種技術(shù)結(jié)合的特點(diǎn)在于： 1) 雙光子FLIM使用的激發(fā)波段較長(zhǎng)， 穿透深度更大， 能夠獲取生物樣品深層的熒光壽命信息； 2) 雙光子顯微成像技術(shù)使用的是脈沖激發(fā)光源， 熒光激發(fā)效率高， 能滿足熒光壽命探測(cè)的需要， 而雙光子顯微成像所固有的層析能力， 能在測(cè)量厚樣品時(shí)避免不同深度信號(hào)之間的干擾[27]. 可見， 將雙光子成像技術(shù)與FLIM技術(shù)結(jié)合， 拓寬了熒光信息探測(cè)模式的維度， 具有廣闊的應(yīng)用前景， 能為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供強(qiáng)有力的研究手段.

圖5 常見的熒光壽命測(cè)量方法及雙光子TCSPC-FLIM 成像系統(tǒng)示意圖 (a) 頻域法； (b) TCSPC 法； (c) 基于TCSPC 的雙光子FLIM 成像系統(tǒng)示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； BS (beam splitter)， 分光鏡； Scan Lens， 掃描鏡； Tube Lens， 鏡筒透鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Obj (objective)， 物鏡； Filter， 濾光片； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測(cè)器； Reference Beam， 參考光； PD (photodiode)， 光電二極管； TCSPC， 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法Fig. 5. Schematic diagram of common fluorescence lifetime measurement methods and imaging systems： (a) Frequency domain method； (b) TCSPC method； (c) schematic diagram of a two-photon FLIM imaging system based on TCSPC. The abbreviations in the figure are as follows： BS， beam splitter； DM， dichroic mirror； Obj， objective； PMT， photomultiplier tube； PD， photodiode； TCSPC， time-correlated single photon counting.

與傳統(tǒng)基于熒光強(qiáng)度的活體成像方法相比， 雙光子FLIM 技術(shù)可以提供更多的生化和醫(yī)學(xué)診斷信息. 目前用雙光子FLIM 技術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞組織的代謝狀態(tài)常用的手段是對(duì)NADH 和FAD 等內(nèi)源性熒光標(biāo)記物進(jìn)行壽命信息探測(cè). 表1 給出了雙光子FLIM 監(jiān)測(cè)NADH 和FAD 的工作原理.

在腫瘤的形成和發(fā)展過程中， 細(xì)胞的代謝情況也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化. 與正常細(xì)胞相比， 癌變前細(xì)胞中的NADH 和FAD 的熒光壽命及氧化還原比存在較大差異[29]. NADH 的生化特性對(duì)于確定細(xì)胞代謝活性至關(guān)重要. 利用雙光子FLIM 測(cè)量游離或結(jié)合蛋白質(zhì)的NADH 的熒光壽命有助于我們推導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)， 這已成為分析診斷癌癥的一種有效工具. Anh 等[30]發(fā)現(xiàn)與普通的二維的細(xì)胞培養(yǎng)方法相比， 在三維的膠原蛋白基質(zhì)中培養(yǎng)的癌細(xì)胞中NADH 壽命更長(zhǎng)， 原因在于三維培養(yǎng)時(shí)更多的NADH 與酶結(jié)合， 此外該團(tuán)隊(duì)還對(duì)比了二維和三維培養(yǎng)形式下的4T1 細(xì)胞對(duì)靶向線粒體和氧化磷酸化途徑的新型MCT 抑制劑(MD1)和TPPBr的代謝反應(yīng). 深圳大學(xué)屈軍樂教授課題組[31]開展了雙光子FLIM 技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究， 已將該技術(shù)與腫瘤的機(jī)理與診斷方法研究結(jié)合起來， 取得了初步的進(jìn)展. 2019 年， 該團(tuán)隊(duì)利用雙光子FLIM技術(shù)從基底細(xì)胞癌切片中提取熒光壽命信息， 構(gòu)建了LSVM 模型， 能更精確評(píng)估皮膚癌癥的發(fā)展階段[32]. 之后， 該團(tuán)隊(duì)又將共聚焦、雙光子、FLIM 技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了多模態(tài)成像系統(tǒng)[33]， 可快速得到生物樣品中的諧波及壽命信息. 如圖6 所示， 通過將FLIM 與相量分析法結(jié)合， 該團(tuán)隊(duì)揭示了肝癌切片中癌轉(zhuǎn)移的能量代謝變化. 另外， 前列腺癌是男性的主要癌癥之一， 目前仍缺乏能夠預(yù)測(cè)前列腺癌治療反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法. 而癌癥中的線粒體功能障礙(如缺陷性氧化磷酸化)通過調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxide species， ROS)產(chǎn)生和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來抑制細(xì)胞凋亡提供了前列腺癌的評(píng)估手段， 其糾正和凋亡的誘導(dǎo)是癌癥治療的可行方法之一. 據(jù)此， Alam等[34]利用FLIM 測(cè)量NADH， FAD 及色氨酸(Trp)三者及其與酶結(jié)合部分的壽命來定量描述前列腺癌細(xì)胞中的線粒體代謝反應(yīng)， 并評(píng)估抗癌藥阿霉素對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用. 在治療之后， NADH 與酶結(jié)合的壽命貢獻(xiàn)增加， 而FAD 與酶結(jié)合的壽命貢獻(xiàn)減少， 通過FLIM 分析推斷NADH/FAD 和細(xì)胞內(nèi)ROS 的氧化還原比增加， 隨后誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡活性. 腦腫瘤也是常見的癌癥之一， 由于腦腫瘤無明顯邊界， 在切除腫瘤組織時(shí)容易傷及正常腦區(qū)域， 腫瘤難以徹底切除. FLIM 由于具有高特異性和非侵入性等優(yōu)點(diǎn)， 已逐漸成為腦腫瘤研究的熱點(diǎn)之一. Poulon 等[35]通過對(duì)人腦腫瘤樣品的內(nèi)源性熒光團(tuán)進(jìn)行分析， 證實(shí)了雙光子FLIM 具有分辨腫瘤與非腫瘤腦組織及腫瘤轉(zhuǎn)移的能力. Kantelhardt等[36]首次將雙光子FLIM 應(yīng)用到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的手術(shù)成像中， 該團(tuán)隊(duì)在活體中觀察發(fā)現(xiàn)了蛛網(wǎng)膜和實(shí)體瘤組織的顯微結(jié)構(gòu)和熒光壽命存在差異， 證明了雙光子FLIM 技術(shù)用于腦腫瘤檢測(cè)的潛力. 在口腔癌研究中， Teh 等[37]通過建立二甲基苯并蒽誘導(dǎo)的倉(cāng)鼠頰囊黏膜癌模型， 同樣基于NADH 和FAD，從細(xì)胞代謝角度出發(fā)， 證實(shí)了雙光子FLIM 技術(shù)具有分辨口腔癌及其他早期癌癥癌前病變的能力.Rück 等[38]從能量代謝角度研究人口腔黏膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)相比正常細(xì)胞， 惡性的口腔黏膜細(xì)胞平均熒光壽命更長(zhǎng)， NADH 含量降低. 除NADH 和FAD 外，研究人員也在積極進(jìn)行其他內(nèi)源性熒光團(tuán)的研究，如Shen 等[39]通過雙光子FLIM 技術(shù)對(duì)內(nèi)源性膽紅素的熒光壽命信息進(jìn)行口腔癌的檢測(cè)研究， 研究表明口腔癌細(xì)胞中的膽紅素?zé)晒鈮勖L(zhǎng). 在胃癌研究中， Li 等[40]用雙光子FLIM 對(duì)新鮮人胃竇黏膜的胃癌樣本進(jìn)行成像， 結(jié)果表明通過熒光壽命可以清晰分辨健康胃黏膜與癌癥區(qū)域的亞結(jié)構(gòu)， 包括表皮結(jié)構(gòu)、固有層、胃癌的間質(zhì)組織及粘液上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等多種細(xì)胞類型， 通過提取子結(jié)構(gòu)的光譜和壽命信息， 還能區(qū)分胃癌的多個(gè)階段.

表1 雙光子FLIM 監(jiān)測(cè)NADH 和FAD 的工作原理[28]Table 1. Working principle of NADH and FAD monitoring by two-photon FLIM[28].

圖6 利用雙光子FLIM 技術(shù)揭示肝臟切片上的癌癥轉(zhuǎn)移[33]Fig. 6. Using two-photon FLIM technology to reveal cancer metastasis on liver slices[33].

雙光子FLIM 技術(shù)也逐漸成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的有力工具之一. 阿爾茲海默癥是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病， 其發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為與淀粉樣蛋白(Aβ)有關(guān). Tyurikova 等[41]用雙光子FLIM 技術(shù)結(jié)合膜片鉗電生理學(xué)監(jiān)測(cè)腦切片中星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的Ca2+濃度， 發(fā)現(xiàn)在切片中注射亞微摩爾的Aβ 會(huì)引發(fā)相鄰星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ca2+濃度顯著提高， 該現(xiàn)象反映Aβ 對(duì)于腦細(xì)胞生理作用存在一定影響. 之后該團(tuán)隊(duì)又采用雙光子FLIM 技術(shù)對(duì)鈣離子熒光指示劑OGB-1 成像[42]， 開發(fā)了一種監(jiān)測(cè)單細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的方法， 在腦切片與原位神經(jīng)細(xì)胞上證明了該方法具有更高的信噪比與靈敏度. Feeks 等[43]將自適應(yīng)光學(xué)與雙光子FLIM結(jié)合， 對(duì)小鼠視網(wǎng)膜中的非固有熒光團(tuán)進(jìn)行成像，如圖7 所示. 通過在小鼠模型中使用遺傳編碼的鈣指示劑， 觀測(cè)雙光子自發(fā)熒光和熒光壽命的變化，可以探測(cè)多種功能反應(yīng). 這項(xiàng)研究還為分子靶向的進(jìn)一步應(yīng)用和疾病進(jìn)展的研究打開了大門， 通過觀察視網(wǎng)膜的熒光壽命變化， 可以為患有糖尿病性視網(wǎng)膜病和斯塔加特病的較早階段患者檢測(cè)疾病進(jìn)展. 帕金森氏癥是目前最困擾人類的病癥之一， Chakraborty 等[44]通過雙光子FLIM 研究神經(jīng)元細(xì)胞中NADH 和FAD 的熒光壽命成分， 以及在MPP+(1-甲基—4 苯基吡啶)處理后壽命的變化. 該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)， 在經(jīng)MPP+處理的細(xì)胞中， 游離和結(jié)合蛋白的NADH 及游離和結(jié)合蛋白的FAD 的熒光壽命都有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低. 這些結(jié)果表明， 在MPP+處理的細(xì)胞中能量產(chǎn)生從氧化磷酸化向厭氧糖酵解的轉(zhuǎn)變， 這可以潛在地用作細(xì)胞代謝指標(biāo)， 以評(píng)估細(xì)胞水平上帕金森氏癥的情況.

圖7 小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管成像[43] (a) 雙光子熒光強(qiáng)度圖像； (b) 圖7(a)中的局部血管； (c) 圖7(b)對(duì)應(yīng)的熒光壽命圖像. 比例尺： 25 μmFig. 7. Imaging of mouse retinal capillaries[43]： (a) Two-photon fluorescence intensity image； (b) local blood vessel in Fig.7 (a)； (c) fluorescence lifetime image corresponding to Fig.7 (b). Scale bar： 25 μm.

盡管雙光子FLIM 技術(shù)已經(jīng)取得了一系列的研究進(jìn)展， 但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨著一些挑戰(zhàn). 如：1)雙光子FLIM 技術(shù)系統(tǒng)較為復(fù)雜， 成本昂貴， 對(duì)激發(fā)光源和探測(cè)器都有著較高要求， 龐大昂貴的硬件系統(tǒng)限制了雙光子FLIM 技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用； 2) 雙光子FLIM 技術(shù)的穿透深度仍限制在幾百微米以內(nèi)， 難以探測(cè)生物組織深層信息； 3) 雙光子FLIM 技術(shù)在數(shù)據(jù)采集與處理上都較為耗時(shí)，采集一張高分辨率的圖像往往要耗時(shí)幾秒甚至幾分鐘， 大大限制了該技術(shù)的應(yīng)用. 未來隨著激發(fā)光源技術(shù)、信號(hào)采集及數(shù)據(jù)處理技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展， 雙光子FLIM 技術(shù)的性能有望得到進(jìn)一步的提升.

4 雙光子光纖內(nèi)窺成像

傳統(tǒng)的2PEF 雖然能為我們提供生物細(xì)胞組織的清晰成像， 但由于其成像系統(tǒng)較復(fù)雜， 器件較多， 體積龐大. 并且在現(xiàn)階段， 大部分對(duì)于生物細(xì)胞組織的成像仍局限在離體細(xì)胞培養(yǎng)， 亦或是局限在生物體表層一定深度. 而生物體內(nèi)的微環(huán)境十分復(fù)雜， 體內(nèi)環(huán)境與離體環(huán)境差別巨大， 在離體環(huán)境下觀察得到的結(jié)果可能與體內(nèi)環(huán)境相差甚遠(yuǎn). 而通過腹窗手術(shù)等方法[45]雖然可以實(shí)現(xiàn)活體的細(xì)胞組織成像， 但這些方法具有高侵入性， 對(duì)生物體損害較大， 也不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的活體成像， 這些因素都限制了雙光子顯微鏡在活體成像中的應(yīng)用. 隨著光纖內(nèi)窺技術(shù)的不斷發(fā)展， 雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)逐漸克服了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的物理限制， 為長(zhǎng)時(shí)間活體成像提供了一種有效手段.

光纖內(nèi)窺成像技術(shù)是將光纖或光纖束從管腔伸入活體內(nèi)部組織器官的一種成像技術(shù)， 由于光纖體積小， 彎曲性好， 對(duì)生物體的侵入性較小， 使用上也比較便捷， 特別適合長(zhǎng)時(shí)間活體內(nèi)部成像. 該技術(shù)通過光纖導(dǎo)入激發(fā)光激發(fā)組織器官產(chǎn)生熒光，然后使用微型探頭收集熒光并傳遞到體外的光電探測(cè)器進(jìn)行成像. 雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)則是集合了2PEF 和光纖內(nèi)窺成像兩者的優(yōu)勢(shì)， 由于2PEF采用的波長(zhǎng)較長(zhǎng)， 在組織中的散射較少， 穿透能力更強(qiáng)， 與光纖內(nèi)窺的結(jié)合能夠獲得更深組織的成像， 且圖像對(duì)比度也能有所提高[46]， 在活體成像領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景. 最早用于雙光子光纖內(nèi)窺成像的光纖是單模光纖， Bird 和Gu 等[47]首次將單模光纖耦合器與2PEF 結(jié)合起來， 證明了單模光纖耦合器能傳輸近紅外波段的超短脈沖激發(fā)光并收集熒光. 但單模光纖在使用上存在缺點(diǎn). 一是單模光纖具有自相位調(diào)制效應(yīng)， 光纖色散系數(shù)也比較高， 飛秒脈沖經(jīng)過單模光纖傳輸后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重畸變， 脈沖會(huì)變寬， 使得在焦點(diǎn)處的熒光激發(fā)效率變低. 二是單模光纖的纖芯較小， 數(shù)值孔徑小， 熒光的收集效率比較低. 為了突破單模光纖帶來的局限， 人們開始采用PCF 來進(jìn)行脈沖光的傳輸[48].相較于單模光纖， PCF 的光引導(dǎo)方式比較獨(dú)特， 比如現(xiàn)階段使用較多的雙包層光子晶體光纖(doubleclad photonic crystal fiber， DC-PCF)， 具有較大的模場(chǎng)半徑， 脈沖光的傳輸效率和熒光的采集效率都很高， 包層光纖還可并入管狀壓電致動(dòng)器中， 實(shí)現(xiàn)雙光子光纖內(nèi)窺系統(tǒng)的微型化. 此外， 光纖耦合器也是雙光子光纖內(nèi)窺成像系統(tǒng)中的重要器件， 光纖耦合器可以實(shí)現(xiàn)光束在兩根甚至多根光纖之間的耦合傳輸， 將激發(fā)光和收集光進(jìn)行分束， 使系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上更加靈活簡(jiǎn)便[49]. 圖8 為雙光子光纖內(nèi)窺成像系統(tǒng)示意圖.

圖8 雙光子光纖內(nèi)窺系統(tǒng)示意圖. 圖中各部分為： Femtosecond Laser， 飛秒激光器； FL (fiber launcher)， 光纖耦合器； PBF(photonic band-gap fiber)， 光子帶隙光纖； Mirror， 反射鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Lens， 透鏡； Filter， 濾光片； PMT(Photomultiplier tube)， 光電倍增管探測(cè)器； DAQ (data acquisition)， 數(shù)據(jù)采集； DCF (double-clad fiber)， 雙包層光纖； Endomicroscope Probe， 內(nèi)窺鏡探頭Fig. 8. Schematic diagram of a two-photon fiber endoscopic system. The abbreviations in the figure are as follows： FL， fiber launcher； PBF， photonic band gap light； DM， dichroic mirror； PMT， Photomultiplier tube； DAQ， data acquisition； DCF， double-clad fiber.

隨著PCF 和微電機(jī)系統(tǒng)(micro-electro-mechanical system， MEMS)掃描器等技術(shù)的不斷發(fā)展，雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)在成像速度、分辨率及系統(tǒng)體積等方面都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步. Tang 等[50]設(shè)計(jì)了使用雙軸MEMS 鏡和DC-PCF 的多光子內(nèi)窺鏡系統(tǒng)， 其中MEMS 掃描儀反射鏡尺寸僅為2 mm， 掃描角度達(dá)到20°， 在x和y軸上的最大可分辨焦點(diǎn)數(shù)目為720 × 720， 采集得到了牛膝關(guān)節(jié)軟骨的多光子顯微圖像. Piyawattanametha 等[51]開發(fā)了一種基于MEMS 二維微型掃描儀的雙光子光纖微型內(nèi)窺鏡， 重量?jī)H為2.9 g， 可用于對(duì)活體小鼠大腦的微脈管系統(tǒng)的體內(nèi)成像. 該團(tuán)隊(duì)通過將光纖附著在活體小鼠的顱骨上來收集體內(nèi)新皮層微血管的雙光子熒光圖像， 此外還可用于追蹤流過觀察血管的紅細(xì)胞. Wu 等[52]開發(fā)了一種緊湊的全光纖掃描內(nèi)窺鏡系統(tǒng)， 用于生物樣品的雙光子熒光和二次諧波(second harmonic generation， SHG)成像. 通過對(duì)上皮組織和口腔組織的深度分辨雙光子熒光成像， 證明了該緊湊的全光纖非線性光學(xué)內(nèi)窺鏡系統(tǒng)具有出色的成像能力， 有望用于實(shí)時(shí)評(píng)估腔內(nèi)器官的上皮和基質(zhì)結(jié)構(gòu). Lee 等[53]開發(fā)了一種更為緊湊的雙光子光纖內(nèi)窺系統(tǒng)， 所有光學(xué)組件的尺寸均為1 mm， 成像頭重量?jī)H為0.6 g， 并成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用到小鼠腦中樹突細(xì)胞的功能性鈣成像， 證實(shí)了該系統(tǒng)可用于清醒自由行為的動(dòng)物的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)的光學(xué)記錄上.雙光子光纖內(nèi)窺技術(shù)在臨床診斷與治療中也發(fā)揮著重要的作用. 2012 年Louradour 團(tuán)隊(duì)[54]提出了激發(fā)波長(zhǎng)可調(diào)的非線性光纖光譜儀， 波長(zhǎng)調(diào)節(jié)范圍為700—900 nm， 脈沖寬度為70 fs， 可以通過彈性蛋白的雙光子信號(hào)和膠原蛋白的SHG 信號(hào)對(duì)離體人肺組織進(jìn)行非線性光譜分析. 在2015 年，該團(tuán)隊(duì)又基于DC-PCF 設(shè)計(jì)了尺寸僅為2.2 mm的雙光子光纖內(nèi)窺鏡， 可以8 幀/s 的速度同時(shí)進(jìn)行雙光子和SHG 信號(hào)的探測(cè)， 橫向和軸向分辨率分別為0.8 μm 和12 μm， 最大成像視場(chǎng)為450 μm×450 μm， 成像穿透深度可以達(dá)到器官表面以下300 μm， 是臨床上實(shí)時(shí)病理狀態(tài)評(píng)估的一種有力工具[55]. 雙光子光纖內(nèi)窺技術(shù)在使用時(shí)會(huì)面臨兩個(gè)挑戰(zhàn)， 一是大多數(shù)生物內(nèi)源性熒光團(tuán)的雙光子吸收位于700—900 nm 的光學(xué)窗口， 而光纖在該窗口具有較大色散； 二是非線性自相位調(diào)制效應(yīng)(self-phase modulation， SPM)會(huì)使得激勵(lì)信號(hào)的頻譜變寬， 導(dǎo)致信號(hào)失真. 該團(tuán)隊(duì)通過引入一根標(biāo)準(zhǔn)保偏單模光纖(polarization maintaining singlemode fiber， PM-SMF)補(bǔ)償頻譜壓縮的非線性效應(yīng)， 以及使用補(bǔ)償二階和三階色散的脈沖擴(kuò)展器，能保證系統(tǒng)在5 m 長(zhǎng)的光纖輸出端傳遞40 fs 以下的紅外激發(fā)脈沖. 此外通過設(shè)計(jì)定制純二氧化硅內(nèi)核的DC-PCF 既能確保高空間分辨率， 還能保證飛秒脈沖在光纖傳輸中的性能不會(huì)因彎曲而產(chǎn)生偏振模色散. DC-PCF 設(shè)計(jì)示意圖如圖9(a)—(c)所示. 在內(nèi)窺鏡輸出端， 該團(tuán)隊(duì)用共振光纖掃描儀和微光學(xué)(micro-optics， MO)搭建了小型成像探頭， 將外徑控制在2.2 mm. 當(dāng)給樣品施加5 mW功率時(shí)， 該系統(tǒng)能以8 幀/s 的高靈敏度對(duì)樣品進(jìn)行成像， 圖9(d)—(k)展示了該系統(tǒng)在離體小鼠切片樣品及人體肺部切片樣品的成像效果. 通過調(diào)整輸入端半波片可選擇不同的正交線性極化， 當(dāng)激發(fā)極化平行于膠原蛋白時(shí)， 可以獲取到更強(qiáng)的SHG信號(hào).

對(duì)于內(nèi)窺成像， 研究者們不僅想觀測(cè)生物體內(nèi)的熒光強(qiáng)度信息， 同時(shí)也希望能夠獲取樣品的生化信息， 由此在2018 年， 該團(tuán)隊(duì)又將雙光子內(nèi)窺成像與FLIM 技術(shù)結(jié)合[56]， 利用DC-PCF 搭建了雙光子FLIM 內(nèi)窺成像系統(tǒng)， 并首次實(shí)現(xiàn)了內(nèi)窺鏡的NADH 壽命成像. Sibai 等[57]將雙光子內(nèi)窺成像技術(shù)與FLIM 技術(shù)結(jié)合， 通過內(nèi)窺鏡監(jiān)測(cè)內(nèi)源熒光團(tuán)的強(qiáng)度、光譜和壽命特性等來研究大腦組織，其結(jié)果表明在恒定的平均激光功率條件下， 短至40 fs 的激發(fā)脈沖即使長(zhǎng)時(shí)間照射組織也不會(huì)對(duì)組織的生化/生物物理特性產(chǎn)生不良影響.

在生物體器官內(nèi)臟的研究診斷和治療中， 使用光學(xué)內(nèi)窺鏡精確控制和操縱微米和納米顆粒也具有重要意義. Gu 等[58]首次展示了用于直接控制和操縱納米珠及金納米棒的光學(xué)非線性內(nèi)窺鏡鑷子(optical nonlinear endoscopic tweezers， ONETs).與相同尺寸的介電納米珠相比， 雙光子吸收可以將熒光納米珠的捕獲力提高多達(dá)4 個(gè)數(shù)量級(jí). 此外，雙光子激發(fā)會(huì)在納米棒上產(chǎn)生等離激元介導(dǎo)的光熱引力， 使納米棒快速上載到目標(biāo)細(xì)胞， 在1 min內(nèi)進(jìn)行熱處理. 該工具在精確指定藥物顆粒的位置和劑量并將金屬納米顆?？焖偕陷d至單個(gè)癌細(xì)胞進(jìn)行治療方面具有較好的應(yīng)用前景.

圖9 用于雙光子內(nèi)窺鏡的空氣-二氧化硅DC-PCF 設(shè)計(jì)及系統(tǒng)成像圖[55] (a) 光纖纖芯示意圖， 二氧化硅部分為灰色， 空氣部分為黑色； (b) 雙包層光纖纖芯截面示意圖； (c) DC-PCF 具有靈活性； (d)-(k) 組織樣本的無標(biāo)記雙光子光纖內(nèi)窺成像， 紅色為TPEF 信號(hào)， 綠色為SHG 信號(hào). (d)， (e) 大鼠尾肌腱； (f) 鼠耳. D： 真皮； E： 表皮； IC： 內(nèi)部軟骨； (g)健康人類肺部樣品(肺泡區(qū)域)；(h) 小鼠動(dòng)脈； (i)-(k)健康人類肺部樣品里3 個(gè)位置的細(xì)胞外基質(zhì). 比例尺： 50 μmFig. 9. Design and system imaging diagram of an Air-silica DC-PCF for a two-photon endoscope[55]： (a) Schematic diagram of the optical fiber core， the silica part is gray， and the air part is black； (b) the cross-sectional schematic view of the double-clad fiber core； (c) DC-PCF is flexible； (d)-(k) Unlabeled two-photon fiber endoscopy imaging of tissue samples， red is TPEF signal， green is SHG signal； (d)， (e) rat tail tendon； (f) mouse ear. D： dermis； E： epidermis； IC： internal cartilage； (g) healthy human lung samples(alveolar regions)； (h) mouse arteries； (i)-(k) extracellular matrix at 3 locations in healthy human lung samples. Scale bar： 50 μm.

雙光子光纖內(nèi)窺成像在體內(nèi)組織器官定性與定量檢查時(shí)具有侵入性低、光損傷小、操作便捷等優(yōu)勢(shì)， 是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中活體成像研究不可或缺的重要工具. 但目前雙光子光纖內(nèi)窺成像仍面臨著如成像分辨率不高、系統(tǒng)尺寸較大、熒光收集效率低等許多技術(shù)挑戰(zhàn)， 隨著PCF 與MEMS 等技術(shù)的發(fā)展， 雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)的性能將得到進(jìn)一步提升， 從而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用.

5 三光子顯微成像

目前， 多光子顯微成像技術(shù)已成為腦科學(xué)研究的重要工具之一， 為了探索大腦的奧秘， 研究者們?cè)诓粩鄬で笱芯可矬w腦內(nèi)更深層信息. 在用2PEF 技術(shù)進(jìn)行腦神經(jīng)科學(xué)研究時(shí)， 由于腦內(nèi)深層組織中散射現(xiàn)象嚴(yán)重， 成像深度受到限制. 盡管采用更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光激發(fā)能進(jìn)一步提高成像深度， 但當(dāng)焦點(diǎn)處信號(hào)熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度一致時(shí)， 成像深度便達(dá)到極限. 在小鼠腦中成像深度大約止步于白質(zhì)層， 很難再往下突破. 一些解決方法， 如插入光學(xué)探針， 則會(huì)對(duì)生物體大腦產(chǎn)生不可逆的傷害.為了能無損地對(duì)腦深層信息進(jìn)行采集， 人們開始將目光轉(zhuǎn)移到三光子顯微成像技術(shù)上.

相較于2PEF， 三光子顯微成像具有以下優(yōu)勢(shì)：1)常用的熒光蛋白的三光子激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)， 通常為1600—1800 nm， 處于生物組織的最佳紅外通光窗口， 在生物組織的穿透效果更好； 2)三光子顯微成像作為更高階的非線性成像方法， 不僅具備雙光子顯微成像的光學(xué)切片能力， 同時(shí)抑制背景信號(hào)能力比雙光子顯微成像也有所提高. 圖10 為激光掃描三光子顯微鏡示意圖.

圖10 激光掃描三光子顯微鏡示意圖. 圖中各部分為： Fiber Laser， 光纖激光器； HWP (half-wave plate)， 半波片； PBS (polarization beam splitter)， 偏振分束器； Mirror， 反射鏡； Lens， 透鏡； PCF (photonic crystal fiber)， 光子晶體光纖； Scan Mirror， 掃描鏡； Scan Lens， 掃描透鏡； Tube Lens， 鏡筒透鏡； DM (dichroic mirror)， 二向色鏡； Filter， 濾光片； Obj (objective)， 物鏡； PMT (photomultiplier tube)， 光電倍增管探測(cè)器Fig. 10. Schematic diagram of a laser scanning three-photon microscope. The abbreviations in the figure are as follows： HWP， halfwave plate； PBS， polarization beam splitter； PCF， photonic crystal fiber； DM， dichroic mirror； Obj， objective； PMT， photomultiplier tube.

早在1996 年， 美國(guó)Cornell 大學(xué)Xu 等[59]便利用鈦寶石鎖模飛秒激光器實(shí)現(xiàn)了1700 nm 波段的三光子成像. 之后該課題組一直從事三光子成像的研究. 2013 年， 為了研究小鼠腦內(nèi)深層結(jié)構(gòu)成像， 該團(tuán)隊(duì)利用孤子自頻移(soliton self-frequency shift， SSFS)方法在光子晶體棒中開發(fā)了一種新的高脈沖能量源[60]， 輸出孤子能量為67 nJ. SSFS 效應(yīng)是指在光纖中一個(gè)孤子通過脈沖內(nèi)受激拉曼散射連續(xù)地將能量從高頻轉(zhuǎn)移到低頻. 提高光纖激光器的激光功率可以使波長(zhǎng)往長(zhǎng)波方向調(diào)諧. 當(dāng)入射光脈寬越小時(shí)其孤子自頻移效應(yīng)越強(qiáng). 此外， 考慮活體小鼠腦內(nèi)組織散射及吸收， 1700 nm 波段是最佳波長(zhǎng)窗口， 圖11(a)展示了基于米氏散射和吸收率的組織模型衰減譜. 基于此， 該團(tuán)隊(duì)將高能光纖激光器的1550 nm 波長(zhǎng)移到所需的1700 nm 窗口， 搭建了一臺(tái)三光子熒光顯微成像系統(tǒng)， 測(cè)得孤子脈沖寬度為65 fs， 脈沖寬度壓縮了6 倍， 獲得的67 nJ 孤子能量也是當(dāng)時(shí)最高. 在1700 nm 波段實(shí)現(xiàn)了對(duì)完整小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的非侵入性、高分辨率的活體成像， 同時(shí)對(duì)小鼠海馬體內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)及紅色熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)元進(jìn)行解析， 成像深度分別能達(dá)到1400 μm 和1200 μm， 成像效果如圖11(b)和圖11(c)所示.

2015 年， 該團(tuán)隊(duì)提出了一種緊湊且便攜的三光子梯度折射率內(nèi)窺鏡， 對(duì)沒有染色的小鼠肺進(jìn)行了離體成像， 證實(shí)該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)光學(xué)活檢的可行性[61]. 2014 年， 該團(tuán)隊(duì)使用基因編碼的鈣指示劑，用三光子顯微鏡在1300 nm 波長(zhǎng)激發(fā)下對(duì)成年小鼠皮質(zhì)的GFP 標(biāo)記的神經(jīng)元進(jìn)行體內(nèi)成像， 展示了皮質(zhì)第6 層(L6)深度的神經(jīng)元活動(dòng)[62]. 2015 年，該團(tuán)隊(duì)利用硅晶片對(duì)1700 nm 激發(fā)的三光子顯微鏡的色散進(jìn)行補(bǔ)償， 使得脈沖寬度減小了1/2 以上， 極大地提高了熒光激發(fā)效率， 從而實(shí)現(xiàn)三光子信號(hào)的4 倍增強(qiáng)效果， 并且展示了在小鼠腦表面以下900 μm 處該信號(hào)增加的現(xiàn)象[63]. 2017 年， 利用功能性成像的GCaMP6 s 標(biāo)記的神經(jīng)元， 該團(tuán)隊(duì)使用三光子顯微成像技術(shù)在1300 nm 波段實(shí)現(xiàn)了在完整小鼠大腦中1 mm 深度的海馬錐體層中記錄多達(dá)150 個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)活動(dòng)， 該方法在無損記錄腦組織深處的高時(shí)空分辨率的神經(jīng)元活動(dòng)方面具有非常大的潛力[64]. 2018 年， 該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種自適應(yīng)飛秒激光源， 能夠把小鼠大腦中多光子成像速度提高10 倍以上， 在700 μm 深度下成像時(shí)可達(dá)到30 幀/s[65]. 同年該團(tuán)隊(duì)又實(shí)現(xiàn)了透過小鼠顱骨下500 μm 深度處的脈管系統(tǒng)的三光子成像， 以及活體小鼠的皮質(zhì)層中GCaMP6 s 的鈣成像[66].2019 年， 該團(tuán)隊(duì)又對(duì)自適應(yīng)飛秒激發(fā)源進(jìn)行了改進(jìn)， 可以僅激發(fā)感興趣的區(qū)域， 使得對(duì)活體小鼠腦成像的多光子成像功率要求降低30 倍， 使得高速縱向神經(jīng)成像成為了可能[67]. 2020 年， 該團(tuán)隊(duì)對(duì)小鼠腦中1300 μm 處的深層組織進(jìn)行三光子鈣成像，并實(shí)現(xiàn)了定量分析. 此外還用三光子顯微成像以細(xì)胞分辨率對(duì)成年斑馬魚頭部深至小腦和視神經(jīng)頂?shù)牟课贿M(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能成像[68].

圖11 小鼠組織模型衰減譜及活體成像[60] (a) 基于米氏散射和吸水率的組織模型的衰減譜； (b) FVB/N 小鼠腦血管三光子圖像的三維重構(gòu)； (c) B6.Cg-Tg(Thy1-Brainbow1.0)HLich/J 小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元三光子圖像的三維重構(gòu)Fig. 11. Attenuation spectrum and in vivo imaging of mouse tissue model[60]： (a) Attenuation spectrum of tissue model based on Mie scattering and water absorption； (b) three-dimensional reconstruction of three-photon image of FVB/N mouse cerebrovascular； (c) B6.Cg-Tg (Thy1-Brainbow1.0) three-dimensional reconstruction of three-photon images of neurons in the brain of HLich/J mice.

浙江大學(xué)錢駿教授課題組一直致力于三光子腦成像熒光探針的開發(fā). 2015 年， 該團(tuán)隊(duì)將金納米棒作為造影劑， 在1000 nm 波長(zhǎng)激發(fā)下， 實(shí)現(xiàn)了小鼠腦內(nèi)760 μm 的成像深度[69]. 為了減輕長(zhǎng)期光照導(dǎo)致的熒光探針的光漂白， 該團(tuán)隊(duì)還合成了一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(aggregation-induced emission，AIE)特性的光穩(wěn)定型發(fā)光劑TPE-TPP， 在1020 nm波長(zhǎng)激發(fā)下的三光子成像中表現(xiàn)出較小的光損傷[70].2016 年， 該組開發(fā)的AIE 熒光探針TTF 在很寬的pH 值范圍內(nèi)化學(xué)性質(zhì)都比較穩(wěn)定， 結(jié)合該探針該團(tuán)隊(duì)用三光子熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)了斑馬魚標(biāo)記胚胎的不同生長(zhǎng)階段， 追蹤時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)120 h[71].2017 年， 該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的1550 nm 波長(zhǎng)激發(fā)的具有較大三光子吸收截面的AIE 探針可實(shí)現(xiàn)穿透顱骨的三光子熒光成像， 成像深度可達(dá)到顱骨下方300 μm，在該深度還可以識(shí)別出2.4 μm 的小血管[72]. 同年，該團(tuán)隊(duì)用AIE 熒光探針實(shí)現(xiàn)了875 μm 深的小鼠大腦血管成像， 是當(dāng)時(shí)基于AIE 熒光探針的三光子成像的最大深度[73]. 2018 年， 該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer， FRET)的納米粒子， 由AIE 染料和NIR染料組成， 該粒子具有增強(qiáng)的三光子近紅外吸收能力[74]. 盡管三光子顯微成像技術(shù)能獲得深層組織中的熒光信息， 但在深層組織成像時(shí)， 三光子熒光信號(hào)仍然較弱， 難以探測(cè)， 而FLIM 技術(shù)探測(cè)的壽命信息卻幾乎不受光強(qiáng)影響. 于是， 該團(tuán)隊(duì)于2019 年嘗試將三光子顯微成像技術(shù)與FLIM 技術(shù)結(jié)合， 以實(shí)現(xiàn)小鼠腦部的三光子FLIM 成像， 成像深度達(dá)到600 μm， 并且可分辨出1.9 μm 的毛細(xì)血管[75]，成像效果如圖12 所示. 2020 年， 該團(tuán)隊(duì)又合成了量子產(chǎn)率高達(dá)42.6 %的AIE 熒光探針， 且第一次用三光子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)完整頭骨鼠腦中風(fēng)過程高穿透深度和高對(duì)比度的成像結(jié)果， 該研究極大地推動(dòng)了活體大腦的非侵入性熒光成像的發(fā)展[76].

深圳大學(xué)王科教授課題組致力于提高三光子熒光成像的穿透深度. 2017 年， 該團(tuán)隊(duì)嘗試用二氧化氘( D2O )代替水作為浸入介質(zhì)， 以提高1700 nm窗口處的透射率[77]. 之后又將硅油作為 D2O 的替代物， 比 D2O 在小鼠白質(zhì)層的三光子信號(hào)提高了17%[78]. 2019 年， 該團(tuán)隊(duì)利用量子點(diǎn)Qtracker655在活體小鼠腦部進(jìn)行成像， 成像深度達(dá)到腦表面以下2100 μm， 且成像速度比之前提升了10 倍， 還可以對(duì)腦表面下1600 μm 處血管的血流速度進(jìn)行測(cè)量， 這是目前世界上最深的活體小鼠多光子腦成像深度， 以及采用多光子成像技術(shù)進(jìn)行血流速度測(cè)量的最大深度[79]， 成像結(jié)果如圖13 所示. 2020 年，該團(tuán)隊(duì)又提出可以通過光子晶體中的SSFS 效應(yīng)產(chǎn)生更多的高能孤子， 在小鼠皮質(zhì)層中發(fā)現(xiàn)圓極化孤子激發(fā)的三光子熒光信號(hào)比線極化高出3.7 倍[80].

與2PEF 類似， 三光子顯微成像在功能成像方面也面臨著諸多挑戰(zhàn). 科研人員也開始嘗試將三光子顯微成像與其他技術(shù)結(jié)合， 拓展三光子顯微成像的應(yīng)用. Weisenburger 等[81]將三光子顯微成像與體成像技術(shù)結(jié)合， 開發(fā)了HyMS (hybrid multiplexed sculpted light microscopy)技術(shù)， 可以在17 Hz頻率下對(duì)12000 個(gè)神經(jīng)元鈣信號(hào)進(jìn)行單細(xì)胞分辨成像， 成像體積可達(dá)到1 mm×1 mm×1.22 mm，并成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用到小鼠聽覺皮層、后頂葉平層和海馬成像中. Klioutchnikov 等[82]設(shè)計(jì)了一種頭戴式三光子顯微鏡， 可以對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠1320 μm深的皮質(zhì)神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行成像， 穩(wěn)定成像時(shí)間超過1 h. 該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的空心光子帶隙晶體光纖(hollow-core photonic bandgap crystal fiber， HC-PBGF) 可以避免光纖彎曲引起的脈沖變化對(duì)分析神經(jīng)元活動(dòng)的影響， 采用的雙通道雙棱鏡序列和可變厚度的體硅結(jié)合還能減少群速度畸變和三階色散.

圖12 活體小鼠腦血管的三光子FLIM 成像[75]Fig. 12. Three-photon FLIM imaging of cerebral blood vessels in living mice[75].

圖13 活體小鼠三光子腦血管成像圖， 2100 μm 的成像深度為目前最深[79]Fig. 13. Three-photon cerebrovascular imaging of living mice. The imaging depth of 2100 μm is currently the deepest[79].

由于信號(hào)背景比的限制， 2PEF 技術(shù)在腦科學(xué)研究中能達(dá)到的成像深度具有一定局限性， 高階的三光子顯微成像技術(shù)由于可實(shí)現(xiàn)更高的成像深度，因而在研究生物腦內(nèi)深層組織的構(gòu)造及生理功能方面發(fā)揮著巨大的作用. 目前三光子顯微成像技術(shù)的應(yīng)用主要受限于光源能量及熒光探針的三光子吸收截面等因素. 未來隨著光纖技術(shù)的發(fā)展， 光源技術(shù)的突破， 熒光探針技術(shù)的進(jìn)步及弱光信號(hào)探測(cè)技術(shù)的改進(jìn)， 三光子顯微成像技術(shù)將在腦科學(xué)研究中發(fā)揮更大的潛力.

6 總結(jié)與展望

近年來， 多光子成像技術(shù)以其高空間分辨率、高穿透深度、低侵入性， 以及固有的光學(xué)層析能力等優(yōu)點(diǎn)， 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得了令人矚目的成果. 傳統(tǒng)的2PEF 發(fā)展已較為成熟， 為了取得進(jìn)一步突破， 多光子成像技術(shù)從實(shí)際的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用出發(fā)， 對(duì)傳統(tǒng)2PEF 在多色成像、功能成像、活體成像、成像深度等方面的不足進(jìn)行了較大改進(jìn)， 例如多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像能在亞細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)多種標(biāo)記熒光團(tuán)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)； 雙光子FLIM技術(shù)可以在進(jìn)行高分辨三維成像的同時(shí)獲取生物組織的生化特性信息， 對(duì)生物組織功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行無標(biāo)記精確定量表征； 雙光子光纖內(nèi)窺成像能深入體內(nèi)進(jìn)行深層組織器官成像， 且相較于普通內(nèi)窺鏡有著較高的分辨率， 能觀察到生物組織內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 三光子熒光顯微成像相較2PEF 穿透深度更深， 分辨率及信噪比也大大提高. 總之， 相比于傳統(tǒng)2PEF， 這幾種多光子成像技術(shù)在成像性能方面得到極大提升， 顯著地拓寬了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍. 然而， 受限于激光器、光纖、探測(cè)器等技術(shù)的發(fā)展， 多光子成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍面臨著巨大挑戰(zhàn). 例如， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像技術(shù)存在系統(tǒng)復(fù)雜， 多種熒光團(tuán)無法同時(shí)最優(yōu)激發(fā)、雙光子激發(fā)效率不高及光譜串?dāng)_等問題；雙光子FLIM 技術(shù)則與2PEF 技術(shù)相同， 也面臨著穿透深度依舊受限的問題， 而且雙光子FLIM系統(tǒng)較為復(fù)雜， 對(duì)光源和探測(cè)器等有嚴(yán)格要求， 成本昂貴. 再者， 受組織自身熒光信號(hào)強(qiáng)度和系統(tǒng)探測(cè)效率的限制， 雙光子FLIM 技術(shù)在數(shù)據(jù)的采集及處理上也十分繁瑣耗時(shí)； 雙光子光纖內(nèi)窺成像雖然在向更小型化發(fā)展， 但對(duì)于活體內(nèi)部組織器官實(shí)時(shí)成像而言系統(tǒng)尺寸仍不夠小， 而且在探測(cè)上對(duì)樣品發(fā)射的熒光的收集效率并不高； 三光子顯微成像技術(shù)成像深度則是受限于光源能量不高， 而且目前用于三光子熒光顯微成像的熒光探針數(shù)量較少， 且亮度有限. 未來隨著激光技術(shù)的發(fā)展和光源能量利用的進(jìn)一步提升， 多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像、雙光子FLIM 和三光子熒光顯微成像的激發(fā)效率與成像深度也會(huì)得到進(jìn)一步提高； 而光纖技術(shù)在信號(hào)傳輸、小型化方面的進(jìn)一步發(fā)展則能使多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像、雙光子光纖內(nèi)窺成像、三光子成像的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更加緊湊合理； MEMS 技術(shù)的發(fā)展能使雙光子光纖內(nèi)窺成像系統(tǒng)尺寸更加緊湊； 更高信號(hào)探測(cè)效率的探測(cè)器的發(fā)展能提高雙光子FLIM 對(duì)樣品的熒光采集效率， 數(shù)據(jù)采集處理技術(shù)的進(jìn)步則能大大減少雙光子FLIM 的圖像處理時(shí)間； 熒光探針技術(shù)的發(fā)展可以為多色雙光子激發(fā)熒光顯微成像及三光子熒光顯微成像技術(shù)提供更多的標(biāo)記選擇， 開發(fā)量子效率更高的熒光探針也有助于提高多光子成像的深度. 此外， 不同種類的多光子成像技術(shù)的結(jié)合也能相互促進(jìn)， 從而大大拓寬其應(yīng)用范圍， 可以預(yù)見， 隨著科研人員的不懈努力，未來激光、光纖、探測(cè)器、熒光探針等技術(shù)必將取得長(zhǎng)足的發(fā)展， 由此促進(jìn)多光子成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上取得更多新進(jìn)展.