羅成江 張曉麗 陳曉琳 林仙軍 王 彬 阮 鑫

（浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州311101）

硝基咪唑（nitroimidazoles）類藥物是帶有硝基的咪唑化合物，其性狀為白色或淡黃色結(jié)晶，弱堿性，能和酸結(jié)合成鹽，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于預(yù)防和治療家禽的滴蟲病、豬的出血性下痢及厭氧菌感染，并具有促生長作用，但是該類藥物對哺乳動物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性。常見硝基咪唑類藥物包括甲硝唑（metronidazole，MNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）、替硝唑（tini?dazole，TNZ）、奧硝唑（ornidazole，ONZ）和異丙硝唑（ipronidazole，IPZ）等。這些藥物在動物體內(nèi)通過C2側(cè)鏈的氧化而被快速代謝，代謝物與原藥具有相似的潛在毒性[1]。因此，歐盟、北美和我國等都禁止了硝基咪唑在食品動物中的使用[2]。

有關(guān)硝基咪唑類藥物檢測方法，目前國內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報道，檢測手段主要包括液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、免疫檢測法和薄層色譜法等[3-8]。目前有關(guān)飼料中常見5 種硝基咪唑類藥物同步測定的HPLC-DAD方法還未見報道。本方法在農(nóng)業(yè)部2483 號公告-7-2016 的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[9]，建立了飼料中5 種硝基咪唑類藥物的HPLC-DAD 測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；配二極管陣列檢測器（安捷倫公司）；AG-285 電子天平（Mettler 公司）；DELTA320 pH 計（Mettler 公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（3-30K，Sigma公司）；氮吹濃縮儀（北京康林科技有限公司）；MS2 minishaker渦旋混勻器（IKA公司）；混合型陽離子固相萃取柱（MCX，60 mg/3 cc，Waters公司）；固相萃取裝置（Supelco公司）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品

地美硝唑?qū)φ掌穪碜灾袊F醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量100%，批號H0391308；甲硝唑、替硝唑、奧硝唑?qū)φ掌肪鶃碜灾袊称匪幤费芯吭?，含量大?9.0%；異丙硝唑?qū)φ掌穪碜灾袊F醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量98.0%，批號H0391308。

1.2.2 試劑

乙酸乙酯、正己烷、磷酸，分析純，購于杭州高晶精細(xì)化工有限公司；氨水、分析純，購于江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；乙腈、色譜純，購于Merck KGaA公司；甲醇、色譜純，購于Merck KGaA 公司；甲酸、色譜純，購于Merck KGaA 公司；水為超純水。

磷酸溶液：取6.4 g 磷酸于1 L 容量瓶中，用水定容至刻度并混勻；淋洗液為水:氨水:甲醇=50:1:1；洗脫液為水:氨水:甲醇=20:5:80；初始流動相溶液為水:甲醇=70:30。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奧硝唑和異丙硝唑10.0 mg，置于100 ml 容量瓶，用甲醇溶解，并定容至刻度，混勻，即為100 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時按照需要用初始流動相將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱取飼料樣品2 g（精確至0.01 g）于50 ml 離心管中，加15 ml 乙酸乙酯，渦旋1 min，以300 r/min 振搖提取30 min，8 000 r/min 離心10 min，上清液倒入另一50 ml離心管中，殘渣再用15 ml乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，為樣品提取液。

1.3.2 凈化

將樣品提取液于35 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，加?00 μl乙酸乙酯，渦動10 s，再加入4 ml正己烷，渦動30 s，全部轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，再向50 ml離心管中加入2 ml磷酸溶液，渦動1 min，全部轉(zhuǎn)移至同一10 ml離心管中，蓋緊，振搖萃取后，在4 ℃下8 000 r/min離心10 min，將下層水相轉(zhuǎn)移至5 ml 離心管中，上層有機(jī)相用2 ml磷酸溶液重復(fù)萃取1次，合并水相作為固相萃取上樣液。

MCX 柱依次用3 ml 乙腈和3 ml 磷酸溶液活化。取固相萃取上樣液過柱，控制流速在1 ml/min內(nèi)。然后依次用3 ml 磷酸溶液，2 ml 淋洗液淋洗，抽真空至近干，用3 ml 洗脫液洗脫。往洗脫液中加入20 μl 甲酸，混勻后于35 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑缓笥? ml初始流動相溶解，過0.45 μm 濾膜后，供高效液相色譜儀測定。

1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），以甲醇為流動相A，以超純水為流動相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；采用二極管陣列檢測器，采集波長范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm，進(jìn)樣量為20 μl，柱溫30 ℃；記錄光譜圖和320 nm波長處的色譜圖。

表1 流動相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

移取適量100 μg/ml 甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奧硝唑及異丙硝唑的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動相稀釋定容，配制成濃度為0.1、0.2、0.5、5、10、25 μg/ml系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，按上述色譜條件分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 5種藥物的線性結(jié)果

2.2 檢測限

取1.2.2 項下的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，進(jìn)行梯度稀釋后添加到陰性飼料中，按1.3 項下的方法進(jìn)行檢測，光譜未失真的最低添加含量作為檢測限，此時色譜圖和光譜圖分別見圖1、圖2。本方法的檢測限為0.1 mg/kg。

圖1 5種硝基咪唑類的檢測限色譜(濃度為0.2 μg/ml）

圖2 5種硝基咪唑類藥物的檢測限光譜

2.3 峰純度及光譜匹配檢查

對供試品溶液及對照品溶液色譜圖中硝基咪唑類藥物（甲硝唑）色譜峰進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，供試品溶液及對照品溶液色譜圖中硝基咪唑類藥物（甲硝唑）峰的純度因子大于閾值，為單一物質(zhì)峰。對供試品溶液及對照品溶液色譜圖中硝基咪唑類藥物（甲硝唑）色譜峰光譜圖進(jìn)行匹配，匹配因子為998.771，可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

圖3 峰純度檢查

2.4 回收率和精密度

通過在空白飼料樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，對5種藥物進(jìn)行0.1、0.5、10 mg/kg三個濃度水平的添加回收試驗，每個濃度設(shè)5個平行，按1.3中的試驗方法處理后檢測，計算出方法的平均回收率為70.8%～92.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.6%～10.8%（見表3）

表3 回收率試驗結(jié)果(n=5)

2.5 固相萃取凈化洗脫條件的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[7-9]報道，用MCX 柱進(jìn)行樣品基質(zhì)中硝基咪唑類藥物的凈化時，淋洗液1 采用磷酸溶液，淋洗液2 采用甲醇或[水+氨水+甲醇（50+1+1）]溶液，洗脫液為[水+氨水+甲醇（10+1+40）]溶液或[水+氨水+甲醇（4+1+16）]溶液。本試驗對淋洗液2及洗脫液分別進(jìn)行組合試驗。當(dāng)采用甲醇作為淋洗液2時，地美硝唑與異丙硝唑回收率非常低，提高洗脫液中氨水濃度和加大洗脫液體積，地美硝唑與異丙硝唑回收率會有所提高，但同時氮吹所需時間加長；當(dāng)采用[水+氨水+甲醇（50+1+1）]溶液作為淋洗液2，[水+氨水+甲醇（10+1+40）]溶液作為洗脫液時，5 種硝基咪唑類藥物的回收率較好，氮吹所需時間較短，因此，本試驗采用磷酸溶液作為淋洗液1，[水+氨水+甲醇（50+1+1）]溶液作為淋洗液2，[水+氨水+甲醇（10+1+40）]溶液作為洗脫液。

3 結(jié)論

本文建立的飼料中5 種硝基咪唑類藥物的HPLC-DAD 測定方法，準(zhǔn)確度和精密度較好，同時通過保留時間及光譜相似度檢查與對照品進(jìn)行比對佐證，實現(xiàn)飼料中5種硝基咪唑類藥物的高效、快速、準(zhǔn)確識別，該方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于飼料中硝基咪唑類藥物的檢測。