鄒文政 林松泉 李忠琴 喬欣君 林章秀

（1.集美大學水產學院，福建廈門361021；2.廈門惠盈動物科技有限公司，福建廈門361023）

在養(yǎng)殖業(yè)中，隨著抗生素、化學殺菌劑的普遍使用，已經逐漸地帶來一系列的弊端，如病菌耐藥性產生、藥物殘留、腸道正常菌群失調，環(huán)境污染等。根據農業(yè)農村部第194 號公告通知，2020 年全面禁抗：飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”，最終目的是要解決抗生素在環(huán)境污染、健康安全、耐藥性超強細菌等負面影響。所以養(yǎng)殖行業(yè)必將朝著減抗替抗的趨勢發(fā)展。在2019 年12 月份正式實施的《水產動物飼用乳酸菌篩選標準》和《水產動物飼用芽孢桿菌篩選標準》，規(guī)范了水產養(yǎng)殖益生菌特別是乳酸菌和芽孢桿菌的篩選，其中安全性規(guī)定所篩菌株對水產動物和人類都必須是安全的，且無抗生素耐藥性及致病性。

益生菌是有利于宿主健康作用的單細胞微生物或組成明確的混合微生物[1]，能調節(jié)腸道菌群平衡，增強機體免疫力等[2]，其與抗生素一樣具有抗菌活性卻無抗生素的種種副作用，是抗生素的重要替代品之一[3]。益生菌主要以乳酸菌類與芽孢桿菌類為主，乳酸菌能夠調節(jié)養(yǎng)殖水體環(huán)境及水產動物腸道微生態(tài)平衡，產生抗菌物質，抑制有害細菌的生長，且能定植腸道[4-7]。據報道[8]，為了防止有關疾病的發(fā)生，只有攝入含有106cfu/ml或以上的益生菌才能充分發(fā)揮其健康促進特性。

益生菌經胃到腸道內的存活能力強弱，是直接關系到產品能否發(fā)揮有益作用。因此益生菌耐酸耐膽汁的特性是評價菌株是否能在腸道中生存與定植的一個重要指標[9]。一般對于作用于人體的益生菌的膽鹽耐受實驗，推薦膽鹽濃度為0.15%～0.3%[10]。根據飲食結構不同，人體胃液pH值具有不同程度的波動，通常pH值維持在2.5～3.5之間，空腹pH值最低可達1.5，在進食后pH值可上升至6或更高，通常食物在胃內停留時間為2～4 h，流食通過胃的時間相對較短，一般1～2 h[11-13]。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，為革蘭氏陽性菌，兼性厭氧菌，屬于乳桿菌屬。目前鼠李糖乳桿菌被認為是第三代微生物益生菌發(fā)酵菌種[14]，它不僅能夠在腸道中定植，能耐胃酸、膽汁，還能預防或治療腹瀉、預防齲齒、增強機體免疫力及抗癌等作用[15-16]。

課題組從仿刺參腸道內分離得到一株益生菌，通過16S rRNA 測序及生理生化鑒定為鼠李糖乳桿菌XX-11，目前尚未見仿刺參源鼠李糖乳桿菌的相關報道。因此，本文對鼠李糖乳桿菌XX-11的部分生物學特性進行研究，旨在為后續(xù)產品開發(fā)、生產應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）XX-11：由本實驗室分離自健康仿刺參腸道，保存于-80 ℃冰箱。

抑菌試驗指示菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GDMCC1.372、大腸桿菌(Escherichia coli)CMCC44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi-B）CMCC50094 購自廣東省微生物菌種保藏中心，創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、鰻弧菌（V. anguillarum）、副溶血性弧菌（V. Parahemo?lyticus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）由集美大學水產學院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用MRS 培養(yǎng)基作為培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基，其中抑菌試驗所用MRS培養(yǎng)基不加吐溫。

1.1.3 藥品試劑

10 種藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；胃蛋白酶購自美國sigma公司；豬膽鹽購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；MJX-250 恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設備廠；LDZX-50KBS 壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DW-86L400超低溫冰箱，浙江捷盛低溫設備有限公司；TG-16M高速冷凍離心機，山東博科科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將保藏于-80 ℃低溫冰箱的鼠李糖乳桿菌XX-11凍存管取出，接種于斜面活化18 h后，轉接于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量90 ml/100 ml，30 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.2 菌株鹽度耐受性試驗

以MRS 液體培養(yǎng)基為基礎，其中醋酸鈉改為氯化鈉來達到調節(jié)鹽度[17]。設置NaCl 質量濃度分別為10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 g/l 液體培養(yǎng)基，裝液量200 ml/250 ml，按2%接種量接入活化菌液，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基濁度變化，確定菌株生長情況。

1.2.3 菌株適宜生長溫度測定試驗

參考陳佩等[18]方法進行，以對數生長期的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)液按2%接種量接入裝液量400 ml/500 ml的MRS 液體培養(yǎng)基，分別在溫度25、30、35、40 ℃與45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，每隔4 h取樣檢測菌液OD600nm值。

1.2.4 菌株藥物敏感性試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法[19]，吸取1 ml活菌數約為108cfu/ml 的菌液，加入15 ml MRS 瓊脂培養(yǎng)基中（50 ℃），混合均勻后傾注倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min后，將平皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌試驗

采用管碟法[20-21]進行菌-菌和菌培養(yǎng)液-菌的抑菌試驗。鼠李糖乳桿菌XX-11于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液置4 ℃冰箱備用；菌沉淀用無菌生理鹽水清洗，離心，重復2 次后，用無菌生理鹽水重懸并調節(jié)菌濃度約為108cfu/ml，置4 ℃冰箱備用。取1 ml 指示菌菌懸液加入50 ℃100 ml MRS瓊脂培養(yǎng)基中搖勻（菌終濃度為105cfu/ml），倒入培養(yǎng)皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入0.20 ml上清液或菌懸液，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，其中弧菌采用30 ℃培養(yǎng)，觀察有無抑菌圈產生，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。

1.2.6 菌株模擬胃液耐酸性試驗

人工胃酸配置方法[22]：0.2 g NaCl與0.35 g胃蛋白酶溶解于適量蒸餾水中，用1 mol/l 鹽酸調節(jié)pH 值為2.0、2.5、3.0，用100 ml容量瓶定容至刻度。將鼠李糖乳桿菌活化后的培養(yǎng)液離心，取菌沉淀稀釋至活菌數約108cfu/ml，分別按1‰接種量加入不同pH 值的人工胃酸液體中，37 ℃水浴恒溫處理時間為0.5、1、2、4、6 h后，稀釋涂板，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，計算菌存活率。

1.2.7 菌株模擬腸液耐膽鹽試驗

參照徐義剛等[23]、趙瑞香等[24]方法進行，將鼠李糖乳桿菌XX-11活化后的培養(yǎng)液離心，取菌沉淀稀釋至活菌數約108cfu/ml，分別按1‰接種量分別加入0.3%、0.5%與0.7%質量濃度的豬膽鹽溶液中，37 ℃水浴恒溫處理0.5、1、2、4 h 與6 h 后，稀釋涂板，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，計算菌存活率。

1.2.8 菌株安全性試驗

參照冼瓊珍等[25]方法進行，以鼠李糖乳桿菌XX-11 采用MRS 液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h 檢測活菌數后，放置4 ℃冰箱冷藏備用。15只健康小鼠，5只為正常對照組，飲潔凈水；另10 只為試驗組，每天飲水添加鼠李糖乳桿菌XX-11 培養(yǎng)液，使菌終濃度為108cfu/ml，連續(xù)10 d，每天觀察小鼠生長情況及10 d后小鼠內臟器官是否出現病變情況。

2 結果與分析

2.1 菌株鹽度耐受性

微生物對溶液滲透壓會有一定程度的耐受性，滲透壓低則出現細胞吸水而使細胞脹破，即水溶現象；滲透壓高則出現細胞失水，造成質壁分離現象。滲透壓過低、過高都會導致微生物細胞死亡。不同的微生物具有不同的耐受滲透壓程度范圍，所以耐受滲透壓能力也是評價微生物菌種優(yōu)劣的一個重要指標。本試驗鼠李糖乳桿菌XX-11 在不同的鹽度范圍內的生長情況如表1所示。

表1 鼠李糖乳桿菌XX-11在不同鹽度下生長情況

由表1 可知，鼠李糖乳桿菌XX-11 在NaCl 質量濃度為10～65 g/l 范圍內生長情況良好，可耐受NaCl質量濃度為70～80 g/l，但生長緩慢，高于85 g/l的NaCl質量濃度則無法正常生長。該研究結果與辛羚等[17]對乳酸菌耐鹽度的研究基本一致，進一步說明鼠李糖乳桿菌能耐受高鹽度的環(huán)境。

2.2 菌株適宜生長溫度

有研究表明[26]鼠李糖乳桿菌的最適生長溫度范圍在30～40 ℃。本研究結果顯示（圖1），鼠李糖乳桿菌XX-11 在25～40 ℃溫度區(qū)間都能良好生長，45 ℃鼠李糖乳桿菌XX-11 生長受抑制。在溫度35 ℃、40 ℃培養(yǎng)時，0～4 h為遲緩期，4～16 h為對數生長期，16 h后進入穩(wěn)定期。這與陳佩等[18]、羅素賢等[27]、劉穎等[28]的研究結果基本相符。而25 ℃與30 ℃培養(yǎng)時，0～8 h為遲緩期，8～24 h處于對數生長期，與35、40 ℃相比，鼠李糖乳桿菌的生長出現滯后現象。結果表明，鼠李糖乳桿菌較適宜生長溫度為35～40 ℃。

圖1 不同溫度下鼠李糖乳桿菌XX-11的生長情況

2.3 菌株藥物敏感性

在養(yǎng)殖業(yè)中，隨著抗生素的廣泛使用，從而逐漸導致細菌耐藥性增強。細菌耐藥性的提高有利有弊，一方面在使用抗生素的同時，益生菌能在腸道存活，能盡快使腸道菌群達到平衡，從而降低胃腸道的不適[29-30]。另一方面，有研究表明[31-33]，細菌耐藥性基因能在微生物菌群間相互傳遞，而使某種病原菌獲得耐藥性，因此菌株耐藥性的安全問題受到極大關注。在2019 年12 月份實施的《水產動物飼用乳酸菌篩選標準》和《水產動物飼用芽孢桿菌篩選標準》中明確規(guī)定所篩菌株對水產動物和人類都必須是安全的，無抗生素耐藥性及致病性。所以對鼠李糖乳桿菌進行抗生素耐藥性的測試顯得極其重要。本研究鼠李糖乳桿菌XX-11對10種抗生素藥敏紙片敏感性見表2。

由表2 可知，鼠李糖乳桿菌XX-11 對痢特靈、復方新諾明與諾氟沙星有一定程度的耐藥性，而對青霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素與紅霉素等7種藥物表現敏感。這與單曉峰等[34]研究報道的鯉魚腸道乳酸菌對慶大霉素耐藥，何亞婷等[35]從鯽魚分離出來的鼠李糖乳桿菌對四環(huán)素與紅霉素耐藥以及團頭魴分離出來的鼠李糖乳桿菌對紅霉素耐藥等研究結果不同。這表明，不同來源益生菌如鼠李糖乳桿菌對藥物的敏感性差異較大。

表2 鼠李糖乳桿菌XX-11對10種藥敏紙片的敏感性

2.4 抑菌試驗結果

有研究表明[36]鼠李糖乳桿菌能產生對其他革蘭氏陰性或陽性的病原菌具有抑制作用的細菌素，它具有蛋白質部分性質，但對熱與酸具有良好的穩(wěn)定性[37]，能較好地保持活性。本研究培養(yǎng)48 h 的鼠李糖乳桿菌XX-11及培養(yǎng)上清液對枯草芽孢桿菌等10株指示菌的抑菌結果如表3所示。

由表3可知，鼠李糖乳桿菌XX-11及其48 h培養(yǎng)上清液對枯草芽孢桿菌等10 株指示菌都有抑制，但前者對10 株指示菌的抑制效果差異不明顯，而上清液對弧菌類病原菌表現出極敏感。此外，鼠李糖乳桿菌XX-11 培養(yǎng)上清液的抑菌效果均較菌體抑菌效果好，這可能是起抑菌作用的主要是代謝產物，且最關鍵抑菌成分可能是代謝產物中的細菌素[39-41]。

表3 鼠李糖乳桿菌XX-11及培養(yǎng)上清液對10株指示菌的抑菌效果

2.5 菌株耐酸性

有報道[42-43]鼠李糖乳桿菌能耐膽酸及有效黏附于腸道中，本研究通過配置人工胃液，鼠李糖乳桿菌XX-11在不同pH值條件下處理其存活率如表4所示。

由表4可知，鼠李糖乳桿菌XX-11在pH值2.0經過1 h 后存活率僅為1.6%，2 h 為0%；而在pH 值2.5、pH 值3.0 的條件下，經過1 h 后存活率超過99%，2 h后仍有很高的存活率，分別為85.8%和99.4%。鼠李糖乳桿菌XX-11 在pH 值3.0 經過4 h 存活率達到86.4%，6 h 后存活率達到68.5%。這與陳佩等[18]的研究在pH 值3.0 處理3 h 存活率大于80%的結果一致。這說明鼠李糖乳桿菌在沒有營養(yǎng)的條件下能在胃蛋白酶及酸性pH 值2.5 共同作用情況下還能有良好的存活率，能通過胃消化從而大部分菌體進入腸道。

表4 鼠李糖乳桿菌XX-11對人工胃液耐受性結果

2.6 菌株耐膽鹽性

小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%范圍內波動[11]，食物在小腸中停留時間為1～4 h。鼠李糖乳桿菌要定植于小腸，這就要求鼠李糖乳桿菌能耐受一定濃度的膽汁，而對人體益生菌的膽鹽耐受試驗，推薦膽鹽濃度在0.15%～0.3%[44]。因此，本試驗采用豬膽鹽濃度為0.3%、0.5%、0.7%，在37 ℃條件下保溫至6 h，通過檢測活菌數來確定其存活率，結果如表5所示。

表5 鼠李糖乳桿菌XX-11對豬膽鹽耐受性結果

通過表5試驗數據可知，鼠李糖乳桿菌XX-11在豬膽鹽濃度在0.3%與0.5%經過37 ℃處理6 h其存活率基本變化不大，存活率皆高于99%以上，這與Haar?man 等[45]的研究較為一致。當豬膽鹽濃度提高至0.7%時，0.5 h 后鼠李糖乳桿菌XX-11 的存活率下降至89.4%，但延長至6 h 時其存活率變化不大，均在85%以上。這說明本研究中的鼠李糖乳桿菌XX-11能耐受較高的豬膽鹽濃度，可在小腸內存活。

2.7 菌株的安全性

鼠李糖乳桿菌XX-11在MRS液體培養(yǎng)基24 h后，將培養(yǎng)物添加到小鼠飲水中（終濃度為108cfu/ml），連續(xù)喂養(yǎng)10 d 后，對照組及試驗組小鼠均健康活潑、無異常表現。剖檢未見任何器官、消化道出現病變。這表明鼠李糖乳桿菌XX-11對小鼠安全無毒副作用。

3 結論

本文通過對仿刺參源鼠李糖乳桿菌XX-11 的部分生物學特性進行研究，結果顯示該菌株能耐高鹽度、胃酸與高膽鹽，且對多種抗生素敏感；通過抑菌試驗與小鼠安全性試驗表明，該菌株及其培養(yǎng)液能抑制指示菌特別是水產病原菌生長，且對小鼠無毒副作用。以上結果表明，鼠李糖乳桿菌XX-11既符合微生態(tài)制劑的要求，又符合《水產動物飼用乳酸菌篩選標準》的要求，使用安全，可作為水產（如海參）、畜禽動物飼料添加的益生菌，甚至在開發(fā)乳酸菌產品功能方面與水產、畜禽動物保健方面具有廣闊的應用前景。