薩茹麗 楊 斌 格根哈斯 錢琳娜

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院 內蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院獸醫(yī)所，內蒙古呼和浩特010031；3.內蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟正藍旗旗委辦公室，內蒙古上都鎮(zhèn)027200）

2020 年起我國開始全面禁止在飼料中添加抗生素。在此背景下，為保證家畜機體健康、生產性能提高、畜產品安全，尋找綠色、環(huán)保、安全、高效的抗生素替代品的研究刻不容緩。藍刺頭（Echinops latifolius Tausch，ELT）又名禹州漏蘆、藍星球，為菊科藍刺頭屬植物。主要分布于南歐、東歐、北非和亞洲，在我國主要分布在東北和西北地區(qū)。中醫(yī)記載藍刺頭根、花序、果實和種子皆可入藥，其味苦、性寒、歸胃經具有清熱解毒、理氣、止痛、排膿止血、消癰下乳等功效。蒙醫(yī)藥典中記載藍刺頭具有固骨質、接骨愈傷、清熱止痛等功效、用于治療骨折、骨熱、刺痛癥、瘡瘍、感冒、心熱、痢疾、血熱及傳染性熱等癥狀具有良好的功效[1-2]。近年國外對于藍刺頭的研究報道主要集中在用藍刺頭屬植物治療偏頭痛、肺結核病、麻風病、血吸蟲病、梅毒、肝病、胃病等方面[3-4]。經分析，藍刺頭中富含有噻吩類、黃酮類、生物堿類等諸多生物活性物質，這些天然活性提取物分別發(fā)揮著其各自獨有的抗氧化、抗炎等生物活性功能[5-6]。研究報道指出，藍刺頭多糖(ETP)作為藍刺頭所含有的天然植物多糖具有體外抗氧化、抗菌和降血糖作用[7-8]。本文在前期研究的基礎上欲對藍刺頭多糖(ETP)對機體免疫機能、抗氧化機能的影響作用進行試驗研究的同時，通過急性經口毒性試驗、骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗確定藍刺頭多糖(ELP)對昆明小鼠的毒性作用，為藍刺頭提取物相關生物活性的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍刺頭花絮采摘自內蒙古呼和浩特市大青山南麓，由內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院臨床獸醫(yī)系中獸醫(yī)教研室楊英教授鑒定。新鮮藍刺頭采摘之后流水沖洗表面灰塵，自然風干，收集花絮后備用。使用時稱取75 ℃烘干至恒重的藍刺頭500 g，加10倍水浸泡12 h，煮沸提取2 h，過濾收集濾液，濾渣再同法煎煮1次后過濾收集濾液，將2 次提取所得濾液合并，使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1 000 ml。邊攪拌邊緩慢加入無水乙醇至乙醇終濃度為80%，4 ℃沉淀24 h，3 000 r/min離心30 min后收集沉淀。沉淀揮去乙醇后用熱水復溶，置于冷凍干燥機中凍干，得藍刺頭粗多糖[2]，經檢測其中多糖含量可達到(298.32±2.73) mg/g。

1.2 主要儀器與試劑

環(huán)磷酰胺（CP，北京酷來搏科技有限公司）、Giem?sa（G1010，北京索萊寶科技有限公司）、精子活體染色液（G2582，北京索萊寶科技有限公司）、全自動酶標儀（Synergy-HT 型，美國BIOTEK 公司）、旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）、顯微鏡（H600L，尼康）、灌胃針、解剖刀、眼科鑷、眼科剪、固定針與固定板、恒溫箱（上海亞榮生化儀器廠）、分析天平（上海方瑞儀器有限公司）、離心機（KLO4A，湖南凱達科學儀器有限公司）等，抗氧化指標的試劑盒購買自南京建成生物技術有限公司，血清免疫指標的檢測由北京華英生物技術有限公司完成。

1.3 試驗動物

清潔級昆明種小鼠，由內蒙古大學生命科學學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXX（蒙）2015-0001，實驗動物使用許可證號為SYXK（蒙）2014-0001。小鼠生長繁殖飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，批號為18123111，飼養(yǎng)過程中各試驗組小鼠全天自由采食、自由飲水，試驗期間動物房環(huán)境溫度為22～24 ℃，濕度45%～50%。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 藍刺頭多糖提取物對小鼠肝臟抗氧化指標的影響

試驗選取50只胎次相近、體重為(20.00±1.20) g左右的清潔級昆明種小鼠，隨機分為五組，每組10 只，分別為空白對照組（灌喂蒸餾水）、陽性對照組（灌喂黃芪多糖1 g/ml）、藍刺頭多糖高劑量組（灌喂1 g/ml的藍刺頭多糖）、藍刺頭多糖中劑量組（灌喂0.5 g/ml的藍刺頭多糖）和藍刺頭多糖低劑量組（灌喂0.25 g/ml的藍刺頭多糖），每只每次灌胃劑量為0.2 ml。試驗進行21 d后，眼球采血，脫頸處死后分離肝臟，生理鹽水沖洗干凈后裝入凍存管中迅速放入液氮內用于抗氧化指標的測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，總抗氧化能力(T-AOC)采用Fe3+還原法測定，過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性采用比色法測定。指標測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定儀器為全自動酶標儀（Synergy-HT 型，美國BIOTEK 公司），具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.2 藍刺頭多糖提取物對小鼠免疫相關指標的影響

試驗選取50只胎次相近、體重為(20.00±1.20) g左右的清潔級昆明種小鼠，隨機分為五組，每組10只，分別為空白對照組(灌喂蒸餾水)、陽性對照組（灌喂黃芪多糖1 g/ml）、藍刺頭多糖高劑量組（灌喂1 g/ml的藍刺頭多糖）、藍刺頭多糖中劑量組（灌喂0.5 g/ml的藍刺頭多糖）和藍刺頭多糖低劑量組（灌喂0.25 g/ml的藍刺頭多糖），每只每次灌胃劑量為0.2 ml。試驗進行21 d后，眼球采血，脫頸處死后解剖，分離并稱量小鼠脾臟、肝臟和胸腺等器官重量，分離血清后分裝并-20 ℃凍存，用于血清IgG、LZM、IL-2、IL-6以及TNF-α含量的測定，測定方法依據(jù)北京華英公司相關試劑盒操作說明書進行。

1.4.3 藍刺頭多糖提取物對小鼠急性經口毒性試驗

選取20 只、體重(22.82±3.90) g，體況良好的試驗昆明種小鼠，雌雄各半，將試驗小鼠稱重后隨機分兩組。通過最大耐受劑量以10 g/(kg·bw)體重的劑量將藍刺頭多糖提取物灌胃給予試驗小鼠，灌胃容量為0.4 ml/20 g 體重，24 h 內灌胃給藥2 次，灌胃間隔為8 h。在測試之前，小鼠禁食不禁水8 h，每個測試組根據(jù)體重計算每只小鼠的灌胃劑量。在灌藥后觀察動物的一般狀態(tài)、體重變化、中毒和死亡等情況，并對死亡動物和到期處死動物進行病理解剖，觀察組織病理變化，觀察期為兩周。

1.4.4 藍刺頭多糖提取物對小鼠骨髓細胞微核試驗

選取70只、體重(23.34±6.40) g，體況良好的小鼠，雌雄各35只，采用完全隨機設計分為5組，每組14只小鼠，分成陽性對照組[環(huán)磷酰胺40 mg/(kg·bw)]、陰性對照組[蒸餾水20 g/(kg·bw)]和藍刺頭多糖低[2.5 g/(kg·bw)]、中[5 g/(kg·bw)]、高[10 g/(kg·bw)]劑量組。各測試組的劑量按照0.4 ml/20 g 小鼠體重計算灌胃量，在24 h內，兩次經口灌胃。第二次灌胃6 h后，脫頸處死小鼠并取兩側股骨，剪取骨骺的每個端部，用鑷子擠出骨髓溶液，將其點在載玻片上預先滴好的小牛血清中，混合后推片。將推好的片子放到染色缸中曬干，用甲醇固定3 min，用Giemsa染液染色20 min后沖洗片子上的染色液，曬干，油鏡下觀察。每只動物計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞（PCE），微核發(fā)生率根據(jù)含微核的PCE計算千分率。計數(shù)200個嗜多染紅細胞，并計算出嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比例（PCE/NCE），正常的PCE/NCE范圍在0.6～1.0之間。

1.4.5 藍刺頭多糖提取物對小鼠精子畸形試驗

選取50 只、體重(22.34±6.40) g，體況良好的雄性小鼠，采用完全隨機設計分為5組，每組10只，分別為陽性對照組[環(huán)磷酰胺40 mg/(kg·bw)]、陰性對照組（蒸餾水[20 g/(kg·bw)]和藍刺頭多糖低[2.5 g/(kg·bw)]、中[5 g/(kg·bw)]、高[10 g/(kg·bw)]劑量組。各測試組的劑量根據(jù)每只小鼠的體重來計算灌胃量，每日1 次，連續(xù)5 d。將不同濃度的試驗藥品根據(jù)0.4 ml/20 g體重給藥。于第一次給藥后第35 d，脫頸處死小鼠，取下兩側附睪，放入1 ml生理鹽水中，剪碎后靜置3～5 min，慢慢搖晃后用紗布將組織碎片除去，吸取精子濾液和精子活體染色液各1滴，滴在載玻片上，混勻，加蓋蓋玻片，放置30～60 s，立即在高倍鏡下觀察。每只動物計數(shù)各類型的畸形精子數(shù)共1 000 個，并計算出精子畸形發(fā)生率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均使用EXCEL 初步整理后，采用SAS9.0 軟件進行方差分析，perdiff 法進行多重比較，P<0.05視為差異顯著，P>0.05視為差異不顯著。

2 結果

2.1 藍刺頭多糖提取物對小鼠肝臟抗氧化指標的影響（見表1）

由表1可知，藍刺頭各試驗劑量組之間SOD酶活性無顯著差異（P>0.05），陽性對照組SOD活性顯著高于藍刺頭中劑量組（P<0.05）；藍刺頭多糖各個試驗劑量組之間T-AOC含量無顯著差異（P>0.05），陽性對照組T-AOC含量顯著高于空白對照組和藍刺頭多糖處理組（P<0.05）；CAT 含量檢測結果顯示，隨著藍刺頭多糖添加劑量的增加，肝臟CAT 含量有增加趨勢，且藍刺頭中劑量組CAT 含量顯著高于空白對照組（P<0.05）；各試驗組GSH-Px含量與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05），均顯著低于陽性對照組（P<0.05）；各試驗處理組之間MDA含量差異不顯著（P>0.05）。

表1 藍刺頭多糖對小鼠肝臟抗氧化指標的影響

2.2 藍刺頭多糖提取物對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（見表2）

表2 藍刺頭多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，藍刺頭多糖中劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著高于其他試驗組（P<0.05）；藍刺頭多糖高劑量組和陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)顯著高于其他試驗組（P<0.05），但藍刺頭多糖高劑量組與陽性對照組間肝臟指數(shù)差異不顯著（P>0.05）；藍刺頭高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著高于其他試驗組，高于陽性對照組，且差異顯著（P<0.05）。

2.3 藍刺頭多糖提取物對小鼠血清免疫指標的影響（見表3）

由表3 可知，與空白對照組相比，藍刺頭多糖高中低劑量組血清IgG 含量均顯著提高（P<0.05），與陽性對照組相比差異不顯著（P>0.05），高中低添加劑量三組之間差異不顯著（P>0.05）；血清TNF-α含量僅藍刺頭高劑量組顯著高于空白對照組、中劑量組與低劑量組（P<0.05），與陽性對照組間差異不顯著（P>0.05）；空白對照組與陽性對照組的IL-6 含量顯著高于藍刺頭試驗組（P<0.05），藍刺頭高中低劑量組之間的差異不顯著（P>0.05）；各試驗組間血清IL-2含量無顯著差異（P>0.05）；藍刺頭低劑量組LZM含量顯著低于其他各組（P<0.05），藍刺頭高劑量組與陽性對照組LZM含量顯著高于其他各組（P<0.05），藍刺頭中劑量組與空白對照組間差異不顯著（P>0.05）；由此得知與空白對照組相比，高劑量的藍刺頭多糖提取物可顯著提高血清IgG、TNF-α、LZM 含量，對血清IL-2 無顯著影響，會使血清IL-6含量顯著降低。

表3 藍刺頭多糖提取物對小鼠血清免疫指標的影響

2.4 藍刺頭多糖急性經口毒性作用（見表4）

表4 藍刺頭多糖對小鼠的急性毒性

由表4 可知，根據(jù)10 000 mg/(kg·bw)劑量的藍刺頭多糖對雌、雄昆明種小鼠灌胃后未見明顯的中毒癥狀，觀察14 d 后無死亡；藍刺頭多糖對雌、雄昆明種小鼠急性經口毒性試驗的最大耐受劑量(MTD)大于10 000 mg/(kg·bw)，屬實際無毒級。

2.5 骨髓細胞微核試驗（見表5）

由表5可知，雄性小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率在受試動物各劑量組間無差異(P>0.05)，且與陰性對照組相比差異不顯著(P>0.05)，各試驗劑量組雄性小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核發(fā)生率顯著低于環(huán)磷酰胺陽性對照組（P<0.05）。各試驗劑量組試驗結果為陰性。雌性小鼠骨髓嗜多染紅細胞的微核發(fā)生率在受試物各劑量組之間無顯著差異(P>0.05)，且與陰性對照組相比差異不顯著(P>0.05)，陽性對照組雌性小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率顯著高于其他試驗組（P<0.05），試驗結果為陰性。由此可知藍刺頭多糖在本試驗條件下對受試小鼠骨髓細胞無抑制作用。

表5 藍刺頭多糖對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響

2.6 精子畸形試驗（見表6）

表6 藍刺頭多糖對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

由表6可知，藍刺頭多糖各劑量組與陰性對照組相比小鼠精子畸形發(fā)生率無顯著差異(P>0.05)，藍刺頭各劑量組小鼠精子畸形發(fā)生率顯著低于環(huán)磷酰胺組（P<0.05），表明藍刺頭多糖在本試驗條件下對小鼠精子無致畸作用。

3 討論

植物提取物不同于化學合成藥物，它是一類從天然植物中獲取的，具有一種或多種生物活性功能的物質。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)植物提取物所富有的生物活性物質如多糖類、黃酮類、酚類、萜類、揮發(fā)油類等物質不僅具有抗菌、抗氧化、提高機體免疫力等功能，其抗病毒、抗癌、抗病、抗炎等生物活性也不斷地被發(fā)現(xiàn)、被證實。但諸多天然植物提取物具有諸多受人矚目的生物活性的同時也具有一定的毒性，尤其是其提取過程中的如溶劑萃取等諸多工藝操作使其安全性問題不容忽視。藍刺頭多糖作為天然植物提取物，前期研究證明其具有較好的體外抗氧化活性與抗菌活性[2]。且藍刺頭多糖(ELP)作為藍刺頭所含有的天然植物多糖具有良好的降血糖作用[7-8]，具有廣泛的應用前景。因此對其急性毒性作用的研究不可缺少。本研究依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》2003版中規(guī)定的保健食品安全性毒理學評價的四個階段內容，以及保健食品選擇毒性試驗的原則，對藍刺頭多糖進行第一階段和第二階段毒理學的安全性評價。第一階段的小鼠最大耐受劑量(maximum tolerated dose,MTD)為10 000 mg/(kg·bw)，大于500 mg/(kg·bw)，小于15 000 mg/(kg·bw)根據(jù)急性毒性劑量分級標準判斷，藍刺頭多糖屬于實際無毒級。本研究選擇小鼠骨髓細胞微核試驗與小鼠精子畸形發(fā)生率試驗作為藍刺頭多糖遺傳毒性檢測，檢測結果證明藍刺頭多糖無遺傳毒性，這也為后續(xù)的相關動物試驗研究奠定了試驗安全基礎。

眾所周知，機體的免疫力是可以識別和消滅各種外來侵入的異物，形成機體特定的防御機制。健全的免疫系統(tǒng)通過處理衰老、損傷、死亡、自身變性細胞以及識別處理體內突變細胞和病毒感染細胞等來維持機體健康。在機體免疫機能的研究中，研究者們通常使用免疫器官指數(shù)大小來反映機體的健康程度及免疫機能的情況。本試驗結果顯示灌胃中劑量藍刺頭多糖提取物的小鼠脾臟指數(shù)顯著高于其他試驗組，灌胃高劑量藍刺頭多糖提取物試驗組的肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于其他幾組，證明藍刺頭多糖可提高機體免疫器官指數(shù)，促進免疫器官的發(fā)育。通過進一步對機體血清免疫指標的測定，可以發(fā)現(xiàn)，灌胃高劑量藍刺頭多糖提取物后試驗小鼠機體的血清IgG、TNFα和LZM 含量顯著提高，對血清IL-2 無顯著影響，血清IL-6含量顯著降低。研究表明血清IL-2、TNF-α含量的升高證明機體免疫功能的加強[9-10]。韋曉晨等[11]研究指出人參葉多糖可顯著提高粵黃雞的免疫器官指數(shù)和血清中IL-2、IL-12、TNF-α等因子的含量，從而起到提升粵黃雞的免疫性能的作用。孫守坤等[12]研究報道刺五加酸性多糖能增加環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫器官臟器指數(shù)、提高TNF-α和IFN-γ水平從而能夠明顯增強免疫抑制小鼠的免疫功能。馬吉鋒等[13]研究報道飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d后，肉牛免疫球蛋白IgG含量明顯提高、IL-2、IL-13、IL-17、IL-19等細胞因子的分泌得到促進，從而提高肉牛機體免疫能力。這也證實，藍刺頭多糖也可以通過提高血清IgG、TNF-α和LZM含量起到一定的免疫增強效果。

隨著生命科學研究的逐步深入，人們逐漸認識到，除了免疫系統(tǒng)，生物在其長期的進化演變過程中，形成了一套完整抗氧化防御系統(tǒng)。在生命活動的過程中，機體內代謝反應所產生大量的氧化自由基（ROS），如果不能及時清除這些代謝產物，過量自由基蓄積會導致機體DNA氧化損傷、蛋白質變性，不僅損傷細胞組織功能，還會引起組織器官一系列的病變，目前研究認為這也是諸多疾病的發(fā)病原因之一。機體內抗氧化系統(tǒng)的強弱直接受多種抗氧化酶活性的直接影響，體內諸多的抗氧化酶中超氧化物歧化酶（SOD）是體內唯一的一種以氧自由基為底物的抗氧化酶，其作用機理是歧化氧自由基生成H2O2，這樣不僅能有效地清除氧自由基，又能夠阻斷毒性更強的羥基自由基的生成，減少MDA等過氧化物的產生，從而起到保護細胞避免氧化損傷的作用。GSH-Px特異性催化GSH 對H2O2的還原反應，從而保護細胞膜結構和功能的完整性；CAT 在一定條件下可直接分解H2O2，保護機體細胞穩(wěn)定的內環(huán)境及細胞的正常生物活性；T-AOC則可以反映機體的健康程度以及機體抗氧化作用的強弱[14-16]。研究證實，植物多糖類提取物可通過提高機體抗氧化酶活性使機體抗氧化機能提高。如付昊等[17]研究報道指出實驗小鼠連續(xù)服用不同劑量(150、300、550 mg/kg)的熟地黃多糖對小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-Px的活性具有一定增強作用，對肝臟和血清中的MDA具有明顯降低效果。許女等[18]研究發(fā)現(xiàn)雞腿菇實體多糖可顯著升高實驗小鼠心、肝、腎、血中GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC的活性，顯著降低MDA 含量，具有較好的抗氧化作用。本試驗結果顯示，灌胃藍刺頭多糖后，試驗小鼠肝臟CAT 酶活性有一定的增高趨勢，SOD、GSH-Px、T-AOC 活性和MDA 含量等無顯著變化，但隨著藍刺頭多糖提取物添加劑量的增加MDA 含量有下降趨勢。研究報道顯示藍刺頭多糖提取物對氧化損傷所致的I 型糖尿病小鼠胰島細胞具有一定的修復和保護作用，而對正常小鼠無此作用[19]，結合藍刺頭多糖體外抗氧化結果，認為藍刺頭多糖提取物對正常的機體內處于平衡狀態(tài)的氧化還原系統(tǒng)無明顯調節(jié)作用，因此其對于疾病或應激狀態(tài)下機體內的氧化還原系統(tǒng)的作用有必要進行更深入的研究。

4 結論

藍刺頭多糖對小鼠急性經口毒性試驗的最大耐受劑量超過10 000 mg/(kg·bw)，屬實際無毒級、對受試小鼠無致畸作用，同時還具有提高機體免疫功能的作用與抗氧化功能的潛力，可作為飼料添加劑、食品保健劑繼續(xù)深入研究與開發(fā)。