汪 鵬 徐嘉欣 黃 鵬 劉 薇 曾建國(guó)*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省中獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

自20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)亞治療劑量抗生素有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的功效以來，飼料中添加抗生素已成為提高養(yǎng)殖效益的有效手段，給畜禽生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。

近二十年來，人們認(rèn)識(shí)到在養(yǎng)殖業(yè)中規(guī)?；褂蔑曈每股貢?huì)引起耐藥菌及藥物殘留、環(huán)境污染[4]等問題，嚴(yán)重威脅人類公共健康安全[5-6]。歐盟于2006年6 月開始全面禁止飼用抗生素在食品用動(dòng)物飼料中添加使用，而中國(guó)也在2020 年開始禁止飼用抗生素的添加使用。為響應(yīng)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展和獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)，安全、有效、可控的新的抗生素替代產(chǎn)品隨著市場(chǎng)和政策應(yīng)運(yùn)而生[7-8]。因此，如何解決這個(gè)問題成為當(dāng)下研究焦點(diǎn)。

“健雞散”作為中華人民共和國(guó)獸藥典方中的復(fù)方中藥配方，由黨參(20 g)、黃芪(20 g)、茯苓(20 g)、六神曲(10 g)、麥芽(10 g)、山楂(炒)(10 g)、甘草(5 g)、檳榔(炒)(5 g)八味中藥組成[9]。已有研究表明其具有增加肉雞成活率和體重的功效[10-11]。本實(shí)驗(yàn)選取了兩種益生菌對(duì)“健雞散”進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并通過肉雞飼喂試驗(yàn)對(duì)“健雞散”發(fā)酵前后的生長(zhǎng)效果等進(jìn)行了對(duì)比，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

酵母浸出粉、胰蛋白胨、瓊脂、麥芽粉購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；NaCl 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；健雞散購(gòu)于阜南諾偉康生物科技有限公司；甲醇為色譜純，購(gòu)于默克醫(yī)藥生物科技公司。

1.1.2 菌種

魯氏接合酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii CCTCC AY 93099，Zr CCTCC AY 93099）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CCTCC AB 90008，Bs CCTCC AB 90008）均購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center For Type Culture Collection，CCTCC）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：200 ml超純水、2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、2 g NaCl，溶于200 ml蒸餾水中，用1 mol/l NaOH 調(diào)至pH 值為5.8，加3 g 瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：200 ml超純水、2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、2 g NaCl，溶于200 ml蒸餾水中，用1 mol/l NaOH調(diào)至pH值為5.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YM固體培養(yǎng)基：1 000 ml超純水、5 g胰蛋白胨、3 g酵母提取物、3 g麥芽粉，溶于200 ml蒸餾水中，用1 mol/l NaOH 調(diào)至pH值為5.8，加20 g瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YM液體培養(yǎng)基：1 000 ml超純水、5 g胰蛋白胨、3 g 酵母提取物、3 g 麥芽粉，溶于200 ml 蒸餾水中，用1 mol/l NaOH 調(diào)至pH 值為5.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

真空干燥箱(上海和晟儀器科技有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)，2 L三角瓶[四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司]，超凈工作臺(tái)(CJ-1D，天津市泰斯特儀器有限公司)，搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，冰箱(海爾冰箱有限公司)，千分之一天平(天津市德安特傳感技術(shù)有限公司)，高溫滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，超高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity Series HPLC 色譜系統(tǒng))，離心機(jī)(eppen?dorf，Centrifuge 5418；Labogene ApS，DK-3450 Lynge Denmark)，超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 梯度條件發(fā)酵健雞散

分別考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量、含水量四個(gè)因素對(duì)酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響。含水量（V/W 水體積/底料重量）分別設(shè)置為50%、60%、70%、80%、90%，設(shè)置發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d，菌種接種量為3%；發(fā)酵溫度分別設(shè)置為24、26、28、30、32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d，菌種接種量為3%，含水量為70%；發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、4、5 d發(fā)酵溫度為30 ℃，菌種接種量為3%，含水量為70%；菌種接種量（V/W 菌液體積/底料重量）分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為3 d，含水量為70%。

1.3.2 供試品前處理

取2 g健雞散或發(fā)酵健雞散粉末，精密稱定，加入25 ml甲醇，超聲提取30 min，離心5 000 r/min 10 min，取上清，0.22 μm濾膜過濾備用。

1.3.3 HPLC色譜條件

色譜柱：Unitary C18 5 μm 100A(250 mm×4.6 mm)；檢測(cè)器：Agilent 1290 Infinity Series HPLC 色譜系統(tǒng)，包括Agilent G1315 DAD 檢測(cè)器、Agilent G1315 C 梯度四元泵和AgilentOpenLab工作站；流動(dòng)相：A(甲醇)，B(0.1%甲酸水)，二元梯度洗脫，梯度洗脫條件為：0～2 min，A(%)5～5，B(%)95～95；2～8 min，A(%)5～13，B(%)95～87；8～25 min，A(%)13～30，B(%)87～70；25～28 min，A(%)30～43，B(%)70～57；28～40 min，A(%)43～60，B(%)57～40；40～50 min，A(%)60～90，B(%)40～10；50～55 min，A(%)90～90，B(%)10～10；55～56 min，A(%)90～5，B(%)10～95；56～60 min，A(%)5～5，B(%)95～95，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；檢測(cè)柱溫：35 ℃；靈敏度：0.8AUFS；流速：1 ml/min；樣品進(jìn)樣量：5 μl。

1.3.4 白羽肉雞飼喂及管理

選取120只1日齡左右，體重相近的白羽肉雞，隨機(jī)均分為4組，分別是空白對(duì)照組、健雞散對(duì)照組、Bs CCTCC AB 90008發(fā)酵組以及Zr CCTCC AY 93099發(fā)酵組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只雞。實(shí)驗(yàn)組按照每1 kg 添加20 g 健雞散或發(fā)酵健雞散配制基礎(chǔ)日糧。已有研究表明，使用飼料添加劑的標(biāo)準(zhǔn)是在整個(gè)飼養(yǎng)期間，或從1 日齡開始飼喂添加劑，所以試驗(yàn)中白羽肉雞42 d 生長(zhǎng)周期全程進(jìn)行添加飼喂發(fā)酵健雞散[12]。嚴(yán)格按照肉雞飼養(yǎng)作業(yè)規(guī)范進(jìn)行相關(guān)管理，每天記錄雞舍的溫度和濕度，并根據(jù)雞的日齡數(shù)做相應(yīng)的調(diào)整，觀察雞群精神狀態(tài)、采食及飲水情況，記錄相關(guān)發(fā)病和死亡情況。在生長(zhǎng)前3 d，環(huán)境溫度為34 ℃，第3 d至第11 d環(huán)境溫度逐漸降低到25 ℃，期間持續(xù)保持良好通風(fēng)，相對(duì)濕度為50%～65%。照明時(shí)間為在第一周每天23 h的光和1 h的黑暗，之后18 h的光和6 h的黑暗[13]。

1.3.5 生長(zhǎng)數(shù)據(jù)記錄

從1日齡開始記錄各組的日糧消耗量、死雞數(shù)量和體重以及第42 d每只雞的體重。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)健雞散

2.1.1 健雞散不發(fā)酵HPLC峰圖

通過高效液相色譜儀對(duì)健雞散成分的分析（見圖1），可以發(fā)現(xiàn)由八味中藥混合制成的健雞散成分極其復(fù)雜，并且不易發(fā)現(xiàn)健雞散的主要成分，無法僅通過對(duì)某一種化學(xué)成分的含量高低來確定藥效，推測(cè)其為多種類型物質(zhì)協(xié)同作用而產(chǎn)生功效。主要包括有部分多糖類、黃酮類、皂苷類、以及生物堿等。

圖1 健雞散HPLC

2.1.2 Zr CCTCC AY 93099單因素梯度發(fā)酵HPLC檢測(cè)總峰面積變化

復(fù)方健雞散由八味中藥按一定比例混合而成，成分復(fù)雜，多以相互協(xié)同作用而起到效果。在Zr CCTCC AY 93099 發(fā)酵健雞散的單因素實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)發(fā)酵后HPLC 的總峰面積評(píng)定發(fā)酵效果。根據(jù)圖2（A）可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，健雞散的總峰面積最大；圖2（B）結(jié)果顯示菌種接種量為6%時(shí)，峰面積達(dá)到最大；圖2（C）顯示60%含水量時(shí)，峰面積達(dá)到最大；圖2（D）顯示當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，峰面積達(dá)到最大。因此，Zr CCTCC AY 93099發(fā)酵健雞散最佳工藝為發(fā)酵時(shí)間4 d、菌種接種量6%、含水量60%和發(fā)酵溫度30 ℃。

2.1.3 Bs CCTCC AB 90008單因素梯度發(fā)酵HPLC檢測(cè)總峰面積變化

在Bs CCTCC AB 90008 發(fā)酵健雞散的單因素實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)發(fā)酵后HPLC 的總峰面積評(píng)定發(fā)酵效果。根據(jù)圖3（A）可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 d 時(shí)，健雞散的總峰面積最大；圖3（B）結(jié)果顯示菌種接種量為4%時(shí)，峰面積達(dá)到最大，分析可能由于枯草芽孢桿菌屬于需氧菌，菌種過多造成發(fā)酵環(huán)境供氧不足，影響菌體活性；圖3（C）顯示80%含水量時(shí)，峰面積達(dá)到最大；圖3（D）顯示當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，峰面積達(dá)到最大。因此，Bs CCTCC AB 90008發(fā)酵健雞散工藝為發(fā)酵時(shí)間4 d、菌種接種量4%、含水量80%和發(fā)酵溫度32 ℃。

2.2 健雞散及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白羽雞生長(zhǎng)性能影響

為了檢查健雞散及其發(fā)酵產(chǎn)品對(duì)白羽肉雞促生長(zhǎng)的效果，對(duì)1～42 日齡白羽肉雞進(jìn)行健雞散發(fā)酵前后飼喂對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)同一養(yǎng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)的白羽肉雞出欄（第42 d）期進(jìn)行了測(cè)量（見表1）。

與空白組的體增重相比，健雞散組平均體增重分別提高4.6%，Bs CCTCC AB 90008 組提高了13.1%，Zr CCTCC AY 93099 組提高了1.33%。因此，Bs CCTCC AB 90008組的體增重效果較佳。

與空白組的FCR 相比，健雞散組FCR 降低了5.83%，Bs CCTCC AB 90008 組降低了2.43%，Zr CCTCC AY 93099組降低了10.68%。因此，Zr CCTCC AY 93099 組FCR 降低最多，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組都比空白對(duì)照組的FCR低，說明經(jīng)過微生物發(fā)酵后的健雞散提高了白羽肉雞的生長(zhǎng)性能。

3 討論

本研究采用HPLC 法以梯度洗脫的方式測(cè)定了發(fā)酵前后總峰面積的變化。由檢測(cè)結(jié)果可知，健雞散經(jīng)過微生物發(fā)酵后，有部分吸收峰發(fā)生了改變，并且發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種接種量、含水量等因素都影響微生物發(fā)酵效率。隨著發(fā)酵條件的梯度變化，都能夠使某一種或多種物質(zhì)含量增加或減少，表明微生物在發(fā)酵過程中可能將其利用、分解成為其他新的物質(zhì)。但由于健雞散由八種中藥復(fù)配而成，不易考察其某一種主要效應(yīng)物質(zhì)，推測(cè)其是多成分協(xié)同作用，所以本實(shí)驗(yàn)中暫未開展正交試驗(yàn)，該部分工作將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中找到復(fù)方中藥效應(yīng)物質(zhì)后進(jìn)行。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵健雞散對(duì)白羽肉雞的體重有所增加，F(xiàn)CR 有所降低，能夠一定程度改善經(jīng)濟(jì)效益，推測(cè)與其中某些成分含量的增加或者減少有關(guān)。但是究竟是產(chǎn)生了何種新的物質(zhì)或是哪一物質(zhì)起到關(guān)鍵性作用以及如何對(duì)動(dòng)物發(fā)生作用的機(jī)理還有待于進(jìn)一步的深入研究。

圖2 Zr CCTCC AY 93099單因素梯度發(fā)酵健雞散的HPLC總峰面積變化

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，無論是中草藥添加劑，還是經(jīng)過微生物發(fā)酵再添加至肉雞基礎(chǔ)日糧使用，均能不同程度地提高肉雞生長(zhǎng)性能，并提高其成活率[14]。張波等[15]研究發(fā)現(xiàn)健雞散具有免疫新城疫的作用但不會(huì)產(chǎn)生耐藥性等不良影響。因此，發(fā)酵中獸藥在未來是極具開發(fā)潛力的飼用抗生素替代品，健雞散的發(fā)酵研究更為進(jìn)一步替抗產(chǎn)品開發(fā)提供指導(dǎo)性思路。

圖3 Bs CCTCC AB 90008單因素梯度發(fā)酵健雞散的HPLC總峰面積變化

表1 健雞散及其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白羽雞生長(zhǎng)性能影響

注：數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示顯著差異（P<0.05），字母相同或無字母表示差異不顯著（P>0.05）；料肉比：使用單因素方差分析和Duncan's 在SPSS 18.0 版中進(jìn)行的多重比較分析，分析了生長(zhǎng)表現(xiàn)數(shù)據(jù)。

項(xiàng)目空白健雞散Bacillus subtilis(CCTCC AB 90008)Zygosaccharomyces rouxii(CCTCC AY 93099)白羽肉雞(42 d)采食量(g)3 926±164.77abc 3 879.15±151.59ab 4 360±266.86d 3 593.32±362.18a體增重(g)1 919±203.69 2 008±106.07 2 171±186.07 1 945±89.63料肉比(FCR)2.06±0.19ab 1.94±0.17ab 2.01±0.06ab 1.84±0.11a

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