高 娜，侯 磊，郝雪蓮，亢澤峰

0引言

細菌性與過敏性結(jié)膜炎均為臨床常見疾病，嚴重時還可導(dǎo)致患者視力下降，并以結(jié)膜充血、水腫、濾泡等為主要癥狀[1]。過敏性結(jié)膜炎主要是由于真菌或塵螨等引起的，其主要根據(jù)實驗室檢查與病理學(xué)檢查等進行診斷及分型。

研究顯示，兒童急性細菌性結(jié)膜炎發(fā)生率呈上升趨勢[2]。細菌性結(jié)膜炎主要為感染性眼科疾病，其主要是由有害病原菌侵染造成的，臨床表現(xiàn)為眼灼熱感、刺癢等，嚴重影響視功能[3]。目前臨床常將細菌性結(jié)膜炎患者誤診為過敏性結(jié)膜炎，因而需選擇適當?shù)姆椒▍^(qū)別診斷。臨床病理學(xué)檢查方法中蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staing，HE)應(yīng)用廣泛，其檢查結(jié)果對臨床用藥及治療方案的選擇均具有重要意義，但操作過程較為復(fù)雜[4]。另有研究顯示，吉姆薩(Giemsa)染色法可用于檢查眼部微生物感染性疾病，并可明顯區(qū)分病原微生物與背景顏色，且操作簡便[5]。關(guān)于HE與Giemsa染色法診斷結(jié)膜炎的相關(guān)研究相對較少，因此本研究比較分析HE與Giemsa染色法對兒童細菌性及過敏性結(jié)膜炎的診斷價值，以期為提高臨床診斷效率提供參考。

1對象和方法

1.2方法

1.2.1采集標本取兩張清潔載玻片并做標記，于酒精燈火焰外焰進行高溫消毒，晾涼備用。鹽酸奧布卡因滴眼液對患者眼瞼結(jié)膜進行表面麻醉，用消毒后的金屬刮鏟輕輕刮取患者上下瞼結(jié)膜，刮取物以甲醛固定于消毒后的載玻片上，風干制片。

1.2.2 HE染色將切片置于二甲苯中進行脫蠟處理并將其放入不同濃度乙醇中浸泡，采用蘇木精將標本進行染色，10min后用蒸餾水清洗并將其放入伊紅染液(0.1%～0.5%)中染色3min，之后在不同濃度梯度(100%、95%、85%、70%)乙醇溶液中進行脫水處理，蒸餾水清洗多余染液后加入中性樹膠封固，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。染色過程中值得注意的問題：(1)使用Gill蘇木精染液防止染液污染；(2)脫蠟時將切片放入透明劑中上下提放多次加快脫蠟；(3)脫水、浸蠟時最適溫度為65℃；(4)染色過程中勿讓切片處于干涸狀態(tài)；(5)樹膠濃度適宜。

1.2.3 Giemsa染色 備好的Giemsa原液中加入蒸餾水進

行稀釋，乙酸與乙醇(比例為1∶3)進行固定，去離子水沖洗，將其置于鹽酸溶液(溫度為60℃)中水解8min，去離子水清洗后置于磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)中浸泡10min，之后吉姆薩染色2h(溫度為5℃)，蒸餾水清洗標本后晾干，中性樹膠封固并將其置于光學(xué)顯微鏡下觀察。染色過程中值得注意的問題：(1)Giemsa稀釋液只可使用一次即不可重復(fù)使用；(2)由于染色時間較長需浸染而非滴染；(3)觀察Giemsa原液是否有效即表面有金色氧化膜；(4)Giemsa原液稀釋后需用濾紙過濾；(5)染色后可根據(jù)染色情況采用正丁醇進行分化。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料用n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

經(jīng)臨床診斷，422例患兒中，病毒性結(jié)膜炎216例，細菌性結(jié)膜炎97例，過敏性結(jié)膜炎109例。HE染色診斷細菌性結(jié)膜炎診斷陽性率及符合率顯著低于Giemsa染色(P<0.001)，而過敏性結(jié)膜炎診斷陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。兩種染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)見圖1、2，過敏性結(jié)膜炎HE染色中嗜酸性粒細胞邊界不清，且胞漿內(nèi)模糊不清；Giemsa染色中嗜酸性粒細胞邊界清楚且胞漿內(nèi)清晰可見。

表1 兩種染色方法診斷陽性率及符合率比較 例(%)

圖1 HE染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)(×400) A：細菌性結(jié)膜炎；B：過敏性結(jié)膜炎。

圖2 Giemsa染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)(×400) A：細菌性結(jié)膜炎；B：過敏性結(jié)膜炎。

3討論

兒童結(jié)膜炎是由于外界或機體自身因素引發(fā)結(jié)膜組織的炎性反應(yīng)，嚴重時還可引起眼部相關(guān)并發(fā)癥，同時嚴重損害視力，因而早期診斷對提高治療效果具有重要意義[8]。過敏性結(jié)膜炎的臨床特征不具有特異性導(dǎo)致診治過程中出現(xiàn)誤診、漏診等情況，嚴重影響患者的身體健康及生活[9-10]。病原菌侵染引起的細菌性結(jié)膜炎與過敏性結(jié)膜炎的臨床特征差異不明顯，臨床診斷時常將二者混淆導(dǎo)致治療效果不佳[11]。結(jié)膜炎的誘因與細胞學(xué)表現(xiàn)不盡相同，而染色涂片檢測對鑒別診斷細菌性結(jié)膜炎與過敏性結(jié)膜炎具有重要意義[12]。因此，本研究分析HE與Giemsa兩種染色方法對兒童細菌性/過敏性結(jié)膜炎的診斷結(jié)果，對臨床診斷與合理選擇治療方案均具有重要意義。

HE染色是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域細胞與組織學(xué)最廣泛的染色方法，在病理實驗室中為常規(guī)染色方法，在染色過程中應(yīng)按照標本的類型采取一定準備措施以提高染色質(zhì)量[13]。HE染色是臨床廣泛使用的一種診斷方法，其具有較高的診斷價值，但該方法操作過程中易受到藥液揮發(fā)等因素影響造成染色效果不明顯，因而應(yīng)將送檢標本進行妥善固定并確保組織及活體成分處于正常狀態(tài)以免影響制片質(zhì)量[14-15]。此外，組織或活體成分及其形態(tài)等遭到破壞將直接影響檢測質(zhì)量，嚴格按照操作程序進行實驗并避免不利因素，HE染色結(jié)果的準確度將會顯著提高[16]。本研究中用蘇木精將細胞核染成藍色，伊紅將細胞漿染成紅色或粉紅色，尤其嗜酸性粒細胞胞漿中充滿嗜酸性顆粒被染成紅色，二者形成鮮明對比，在顯微鏡低倍鏡下非常易于觀察，但對細菌染色則無特異性，說明應(yīng)用HE染色方法診斷過敏性結(jié)膜炎是非常高效、敏感的。提示病理診斷技術(shù)可有效判斷細菌性或過敏性結(jié)膜炎，其中HE染色技術(shù)占據(jù)重要地位，但仍需改進HE染色操作技術(shù)以便提高制片質(zhì)量并進一步提高染色準確率從而提高病理診斷準確率。

Giemsa染色法可用于觀察分析染色體核型，研究顯示染色體異常與機體生理病理過程密切相關(guān)[17]。研究表明Giemsa染色法可清晰觀察胃病患者幽門螺桿菌的分布情況，此方法取材直接并可直接獲得結(jié)果，有利于臨床診斷及治療[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)將病理組織切片進行Giemsa染色有利于病理分型的劃分并可清楚顯示真菌感染部位，對提高臨床治療效果具有重要應(yīng)用價值[19-20]。Giemsa染色法過程簡單，染液容易配置，細菌被染成藍到紫紅色，細菌的形態(tài)可清晰呈現(xiàn)，細胞漿呈淡藍色，遇嗜酸性顆?？蓪⑵淙境砷偌t色，但均必須于鏡下觀察，才能更加明確。本研究結(jié)果顯示HE染色診斷細菌性結(jié)膜炎陽性率及符合率顯著低于Giemsa染色，而過敏性結(jié)膜炎陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示HE與Giemsa染色法均可促使結(jié)膜炎標本中嗜酸性粒細胞顯色，但Giemsa染色效果優(yōu)于HE染色法。本研究結(jié)果揭示應(yīng)用Giemsa染色方法診斷細菌性結(jié)膜炎是非常準確的，同時可以結(jié)合HE染色再次驗證過敏性結(jié)膜炎，并可有助于臨床及時對癥用藥從而提高治愈率。

綜上所述，Giemsa染色比HE染色對細菌性結(jié)膜炎診斷效果好，且不易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，同時有助于臨床提高細菌性與過敏性結(jié)膜炎的診斷率，為提高兒童細菌性與過敏性結(jié)膜炎的治療方案提供參考依據(jù)。

1楊森, 唐建明, 忽俊, 等. 疏風明目方超聲霧化對過敏性結(jié)膜炎患者淚膜穩(wěn)定性及淚液相關(guān)指標的影響. 國際眼科雜志 2019; 19(6): 1068-1071

2薛艷萍. 鹽酸左氧氟沙星滴眼液治療細菌性結(jié)膜炎的臨床效果分析. 河南醫(yī)學(xué)研究 2016; 25(12): 2162-2163