蔣益忠，林麗娟，辛海量，金玉娥，蔣益萍，薛黎明 （. 浙江省東陽(yáng)市中醫(yī)院，浙江 東陽(yáng) 05；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 004；. 上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所，上海 006）

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是以骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病，可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，多見于老年人。衰老是致骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要因素，隨著機(jī)體的衰老，骨骼中過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟，抑制成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)及骨基質(zhì)的礦化，同時(shí)促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。2018 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布OP 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)65歲以上人群OP 患病率達(dá)32.0%，其中，男性為10.7%，女性為51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在臨床上常單獨(dú)或協(xié)同用于防治老年性骨質(zhì)疏松癥，療效顯著[2-3]，是我國(guó)現(xiàn)版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》和《骨質(zhì)疏松癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南》的推薦藥物[1-2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，MK4能促進(jìn)成骨增殖、分化和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白，在成骨細(xì)胞骨形成中發(fā)揮保護(hù)作用[5]，且能阻止成骨細(xì)胞凋亡[6]。過(guò)氧化氫(H2O2)是ROS 在體內(nèi)存在的主要形式，會(huì)穿透成骨細(xì)胞造成細(xì)胞損傷，本研究擬探討MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用和調(diào)控機(jī)制，闡明MK4抗老年性骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

1 材料

成骨細(xì)胞系MC3T3-El（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞資源中心）；特級(jí)胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素和鏈霉素混合液)和PBS 緩沖液(pH=7.2)均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；噻唑藍(lán)（MTT）、MK4（Sigma 公司）。過(guò)氧化氫 (H2O2，比利時(shí) Acros Organics 公司）；丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、JC-1 線粒體膜電勢(shì)(MMP)試劑盒和活性氧(ROS)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒（均為Thermo Fisher 公司產(chǎn)品）；叉頭框蛋白 (FoxO1 和FoxO3)、β 細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因 2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2 方法

2.1 MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞活力

復(fù)蘇MC3T3-El 小鼠成骨細(xì)胞系，置于5 ml含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中，放入 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng) 24 h 后，分別采用 0、10、20、50 和 100 μmol/L(n =10)的 H2O2處理，培養(yǎng) 4、12、24 h 后，采用碧云天MTT 試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后，并按空白、氧化應(yīng)激模型、藥物劑量分組：①對(duì)照組，②選擇合適濃度H2O2組，③H2O2+10 μmol/L MK4組，④H2O2+1 μmol/L MK4組，⑤H2O2+ 0.1 μmol/L MK4組。加入藥物培養(yǎng)24 h，采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

2.2 成骨細(xì)胞 ALP 活性

以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組，連續(xù)培養(yǎng)6 d，每3 d 換液1 次，采用硝基苯酚磷酸二鈉法檢測(cè)ALP 活性。給藥6 d 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗 3 次，依次加入 100 μl 二乙醇胺（50 mmol/L），50 μl 的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉（2.5 mmol/L），在 37 ℃孵育 30 min，再加入 50 μl 的 0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，置405nm 處，測(cè)吸光度值(A)。以不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，ALP 活性由每孔釋放的對(duì)硝基苯酚的μmol 數(shù)表示。

2.3 成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)面積

以5×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞將MC3T3-El 細(xì)胞接種于 12 孔板內(nèi)，放入 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，12 h 后換骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml 抗壞血酸以及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h，按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組，每3 d 換液1 次，連續(xù)培養(yǎng)14 d，采用0.1%茜素紅-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色，37 ℃下染色30 min，采用倒置相差顯微鏡 (Leica DMI 3000)觀察，并隨機(jī)拍照10 張，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨結(jié)節(jié)面積。

2.4 細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、ROS 和氧化應(yīng)激酶MDA、GSH、SOD 測(cè)定

以 2×105/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組，干預(yù)24 h 后，用熒光酶標(biāo)儀法分別測(cè)定JC-1 單體和復(fù)合物的熒光，DCFH-DA 探針法測(cè)活性氧水平，ELISA 法測(cè)定 GSH、SOD 和 MDA 水平。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板，培養(yǎng) 12 h 后，按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組，干預(yù)24 h 后，依據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)。

2.6 RT-PCR

以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板，培養(yǎng) 12 h 后，按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組，干預(yù)24 h 后，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄后，分別 對(duì)GAPDH 、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2 和bax 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，引物序列見表 1，PCR 反應(yīng)條件：采用預(yù)變性 95 ℃、10 min，變性 95 ℃、45 s，退火 60 ℃、45 s，延伸 72 ℃、50 s，循環(huán) 40 次，總反應(yīng)體系為 10 μl。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SPSS 軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（α=0.05），再采用Student's t test 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 小鼠引物序列

3 結(jié)果

3.1 H2O2 處理 MC3T3-El 成骨細(xì)胞

MC3T3-E1 經(jīng) 0～100 μmol/L H2O2分別處理4、12、24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0～100 μmol/L H2O2處理4 h 對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)顯著性影響(P＞0.05)，處理12 h 后，在 50 和 100 μmol/L H2O2下的細(xì)胞活力顯著降低，分別降低19.4%和33.4%。H2O2干預(yù)24 h后，在 20、50、100 μmol/L 均具有顯著性差異，分別降低13.2%，47.4%和57.9%(表2)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇 20 μmol/L處理 24 h。

3.2 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞增殖、ALP 活性和骨結(jié)節(jié)形成的影響

MC3T3-E1 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理 24 h 后，結(jié)果顯示，顯著抑制了成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力(P＜0.05)，ALP 活性 (P＜0.05) 和骨結(jié)節(jié)形成面積 (P＜0.05)，與空白組比較，分別降低13%、16%和85%，見表 3 和圖 1。與模型組比較，MK4在 1～10 μmol/L可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞增殖(P＜0.05)。同樣，MK4在 1～10 μmol/L 能顯著改善 ALP 活性 (P＜0.05)和提高骨結(jié)節(jié)形成面積(P＜0.05)，分別增加50.7%和 44.5% (表 3 和圖 1)。

3.3 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、活性氧和抗氧化酶的影響

MC3T3-E1 成骨細(xì)胞 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理24 h 后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著降低成骨細(xì)胞膜電勢(shì)和增高活性氧含量 (P＜0.05)。與模型組比較，MK4在10 μmol/L 可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞膜電勢(shì)升高和降低活性氧含量(P＜0.05)。與空白組比較，20 μmol/L H2O2能顯著降低 FoxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA 表達(dá) (P＜0.05)。與 H2O2組比較，給予10 μmol/L MK4后，F(xiàn)oxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA表達(dá)均顯著增高(P＜0.01)。

3.4 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

在通道1 和通道2 觀察單個(gè)細(xì)胞分布區(qū)域，選定99.9%的細(xì)胞區(qū)域用于后續(xù)分析，在通道3 和通道4 觀察凋亡細(xì)胞分布，Q4 為正常細(xì)胞，Q1 為壞死細(xì)胞；Q2 為晚期凋亡細(xì)胞，Q3 為早期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組比較，20 μmol/L H2O2處理 24 h 后，細(xì)胞的凋亡率顯著增高(P＜0.05)。經(jīng)0.1～10 μmol/L 濃度 MK4干預(yù) 24 h 后發(fā)現(xiàn)，1～10 μmol/L濃度MK4能顯著降低細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，與對(duì)照組相近，見表3 和圖2。與空白組比較，20 μmol/L H2O2能顯著降低 Bcl-2 的 mRNA 表達(dá) (P＜0.001)，bax 表達(dá)無(wú)顯著差異，給予 10 μmol/L MK4后，Bcl-2和bax 的mRNA 表達(dá)均顯著增高(P＜0.01)，見圖3。H2O2組的bax/Bcl-2 比值為對(duì)照組的22.5 倍，而MK4處理后降低至對(duì)照組的7.6 倍。

表2 H2O2 處理的時(shí)間與濃度對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

表3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞的影響

圖1 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)的影響 (×200)

圖2 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

圖3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞氧化和凋亡相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響

4 結(jié)論與討論

骨代謝中，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)FoxOs 轉(zhuǎn)錄因子的活性，產(chǎn)生抗氧化物酶，對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)骨骼的損傷，包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6 等，其中，F(xiàn)oxO1 和FoxO3 是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化還原平衡和成骨功能的主要分子[7]?；钚匝蹩杉せ頕oxO1 的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)線粒體抗氧化酶Mn-SOD 的活性[8]。隨著活性氧的升高，F(xiàn)oxO3 下調(diào)，成骨細(xì)胞分化受損，抑制骨形成作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MK4對(duì)H2O2引起的氧化應(yīng)激具有顯著的改善作用，降低活性氧和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 水平，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1、FoxO3 和抗氧化酶SOD 的mRNA 表達(dá)。

Bcl-2 蛋白可減少氧化應(yīng)激水平，而bax 基因可與Bcl-2 形成異源二聚體，抑制Bcl-2 的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MK4可上調(diào)Bcl-2/bax 比值，抑制了成骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能顯著提高成骨細(xì)胞凋亡率，同時(shí)增加bax 的表達(dá)，降低Bcl-2 蛋白表達(dá)。MK4處理組對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的拮抗作用明顯，隨著劑量濃度增加而增加。MK4在在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，可顯著上調(diào)Bcl-2，下調(diào)bax 的基因表達(dá)，bax/Bcl-2 比值顯著降低，抑制了成骨細(xì)胞凋亡。

FoxOs 激活促進(jìn)Bcl-2 相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)蛋白(Bim)轉(zhuǎn)錄，Bim 是線粒體凋亡通路的核心調(diào)控者，引起成骨細(xì)胞線粒體膜電位降低[10]。線粒體跨膜電位降低說(shuō)明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP) 過(guò)度開放。若MPTP 過(guò)度開放，易引起呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓增高，使得促凋亡活性物質(zhì)從線粒體釋放入細(xì)胞基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MK4顯著改善了H2O2刺激的成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)降低，表明MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，MK4能顯著抑制H2O2刺激的成骨細(xì)胞氧化損傷，機(jī)制與FoxO 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。同時(shí)，MK4對(duì)H2O2引起的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，其機(jī)制為上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)bax 的基因表達(dá)。