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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討活血化瘀藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制

        2020-12-04 06:36:48倪喆鑫俞超芹海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系上海200433
        藥學(xué)實踐雜志 2020年6期
        關(guān)鍵詞:中藥數(shù)據(jù)庫

        丁 杰,倪喆鑫,程 雯,俞超芹 (海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系,上海 200433)

        子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是臨床上 最為常見的慢性婦科疾病之一,以慢性盆腔疼痛、月經(jīng)紊亂和不孕為主要的臨床表現(xiàn)。EM 本質(zhì)是血瘀證,臨床治療時以活血化瘀為主,常用的藥物有桃仁、紅花、澤蘭、丹參、益母草、川牛膝、王不留行等,能夠有效緩解患者痛經(jīng)、非經(jīng)期盆腔痛等癥狀[1]。

        目前活血化瘀類中藥對EM 治療的具體機制不是很清晰,其針對的靶點也不是很明了。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物網(wǎng)絡(luò)作為研究對象,探究藥物、靶點、疾病之間的聯(lián)系,系統(tǒng)完整地研究藥物的機制,可展現(xiàn)出藥物對于多個靶點、多個通路不同影響。因為和中醫(yī)整體觀念天然契合,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥研究中[2-3]。在本研究中,筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究活血化瘀類中藥治療EM 的作用機制,構(gòu)建“化合物-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò),并初步探析何種活血化瘀藥在EM 治療中更具優(yōu)勢,為臨床用藥以及進一步實驗研究提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 活血化瘀類中藥確認

        根據(jù)衛(wèi)生部“十一五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》分類,確認桃仁、紅花、澤蘭、丹參、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀藥為本次主要研究對象。

        1.2 中藥有效成分以及相關(guān)靶點的獲取

        利用中藥化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫TCMSP 平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),檢索七味中藥所含活性成分。依據(jù)數(shù)據(jù)庫指南要求,將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30% 以及類藥性(druglike,DL)≥0.18 作為篩選條件,對活性成分進行篩選[4]。OB 值是評價藥物能否發(fā)揮藥效的重要藥動學(xué)參數(shù),DL 值是指化合物與所有已知藥物之間的相似程度。上述2 個參數(shù)是評價中藥化學(xué)成分吸收、分布、代謝、排泄的關(guān)鍵參數(shù)。獲得符合OB、DL 參數(shù)有效活性成分后,利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢各有效活性成分對應(yīng)相關(guān)靶點。利用Venn 圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對藥物化學(xué)成分以及相關(guān)靶點進行共同點分析,尋找活血化瘀中藥共有成分和作用靶點。

        1.3 EM 相關(guān)靶點基因確認

        利用美國國立生物技術(shù)信息中心Gene 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)將所獲靶點信息轉(zhuǎn)換成基因名稱。查詢GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫,獲得與EM 相關(guān)基因靶點。最后將每種中藥的作用靶點對應(yīng)的Gene Symbol 與EM 基因進行比對,獲得每種中藥可能影響EM 的相關(guān)基因,利用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)[5]。

        1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

        為進一步研究靶點之間的相互關(guān)系,將活血化瘀藥共同靶點上傳至線上軟件 STRING(http://string db.org),構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為Homosapiens,minimum required interaction score 調(diào)整為highest confidence,隱藏網(wǎng)絡(luò)圖中游離節(jié)點,獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。

        1.5 KGEE 通路分析

        利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(https://www.keg g.jp/)查詢每種中藥針對EM 的相關(guān)基因,獲得相關(guān)KEGG 通路信息。篩選各中藥KEGG 通路中相關(guān)基因富集情況,并利用Prism 8.0 軟件繪制通路靶點富集熱圖。

        2 結(jié)果

        2.1 活血化瘀類中藥有效成分及對應(yīng)靶點的獲取

        按照要求從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出各中藥有效成分,刪除重復(fù)項,共有94 種有效成分(supplementary materials table S1)。其中丹參有效活性成分達到65 個,而澤蘭有效活性成分只有2 個。未能發(fā)現(xiàn)七味活血化瘀藥共同有效成分,但β-谷固醇為川牛膝、紅花、桃仁、澤蘭所共有,槲皮素為川牛膝、紅花、王不留行、益母草所共有,是涉及活血化瘀類中藥最多的2 種有效成分(supplementary materials table S2)。與此同時,我們找到了七味中藥所共有的19 個作用靶點(表1),包括孕酮受體(progesterone receptor)、前列腺素G/H 合成酶 1(prostaglandin G/H synthase 1)、前列腺素 G/H 合成酶 2(prostaglandin G/H synthase 2)、凋亡調(diào)節(jié)劑 Bcl-2(apoptosis regulator Bcl-2)、核受體共激活劑(nuclear receptor coactivator 2)等。

        表1 七種活血化瘀中藥共有的 19 個靶點

        2.2 EM 相關(guān)靶點確認

        利用人類基因數(shù)據(jù)庫查找EM 作用靶點,與七味中藥有效成分對應(yīng)靶點進行比對,發(fā)現(xiàn)紅花所含相關(guān)靶點數(shù)量最多,達到103 個;而桃仁、澤蘭所含相關(guān)靶點數(shù)量最少,為14 個(圖1A);王不留行所含相關(guān)靶點占有效成分作用靶點比例最高,為54.7%;而桃仁最低,為29.8%(圖1B)。經(jīng)過去重處理后,七味中藥所含EM 相關(guān)靶點共119 個(supplementary materials table S3)。利用 Cytoscape3.6.0 軟件進行成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析,獲得圖2,其中共計216 個節(jié)點,其中黃色節(jié)點為活血化瘀藥有效活性成分,而藍色節(jié)點代表EM 相關(guān)靶點。利用軟件自帶分析功能,對于網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點度值進行分析,網(wǎng)絡(luò)中某些節(jié)點度值較高,提示該節(jié)點為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(supplementary materials table S4)。在各中藥所含有效成分中,槲皮素展現(xiàn)出極高的連接度(度值=87),遠超其他有效成分,而其余較高連接度值依次是木犀草素(度值=43)、山柰酚(度值=33)、黃芩素(度值=23)、丹參酮A(度值=20)、花生四烯酸(度值=20)、β-谷固醇(度值=18)。中藥是一個多有效成分的復(fù)雜系統(tǒng),一個有效成分可作用于多個靶點,協(xié)同作用于某種疾病的治療。而在靶點的分析中,較高連接度的靶點可能在EM 的治療作用中起著重要的作用。前列腺素G/H 合酶2(PTGS2,度值=82)、前列腺素 G/H 合酶 1(PTGS1,度值=39)兩者擁有最高的度值,是臨床上炎性疾病治療的主要靶點;核受體輔活化子2(NCOA2,度值=35)、核受體輔活化子1(NCOA1,度值=34)緊跟其后,同樣在各炎癥通路中作用顯著;凝血酶(度值=31)是臨床上治療出血的重要靶點,直接作用于血液凝固過程的最后一環(huán);Mu-type 阿片受體(OPRM1,度值=30)則涉及到中樞鎮(zhèn)痛功能。上述靶點均和EM 癥狀及病機之間有著密切的關(guān)系。

        圖1 七味活血化瘀中藥 EM 相關(guān)靶點數(shù)量及所占比例

        2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

        利用STRING 軟件構(gòu)建靶點PPI 網(wǎng)絡(luò),圖中包含119 個節(jié)點,505 條邊,所有節(jié)點平均度值為8.49,具體見圖3。根據(jù)“度值>均值”篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點56 個(supplementary materials table S6),前 9 位關(guān)鍵節(jié)點,平均度值為 88,見表 2,與PPI 網(wǎng)絡(luò)74%節(jié)點存在相互作用關(guān)系,提示它們在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用,可能是活血化瘀藥物治療EM 的關(guān)鍵所在。

        2.4 KEGG 通路分析

        利用KEGG 數(shù)據(jù)庫查詢每種中藥針對EM 的相關(guān)基因,獲得相關(guān)KEGG 通路信息。整理各中藥KEGG 通路相關(guān)基因富集情況,發(fā)現(xiàn)七味中藥共有信號通路44 條(supplementary materials table S5),篩選出與 EM 密切相關(guān)的 19 條通路(表 3)。從表3 中,不難發(fā)現(xiàn),19 條通路涉及性激素、炎癥、細胞調(diào)亡以及血管生成等各個方面,其中炎癥相關(guān)通路達到7 條,為所有通路中最多。利用Prism 8.0 軟件繪制通路靶點富集熱圖,根據(jù)圖4 可知,在系列通路中,澤蘭與桃仁作用均弱于其他五味中藥。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF 三條信號通路中,多味中藥靶點存在高度富集,紅花在PI3K-Akt 信號通路中顯著富集,遠超該藥其他通路,值得注意。

        3 討論

        圖2 活血化瘀中藥主要成分?靶點圖

        本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中提取出了94 個符合標準的成分,通過VENE 圖去重以及分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓撲特性后,發(fā)現(xiàn)槲皮素為四味活血化瘀藥所共有,與83 種EM 相關(guān)靶點存在關(guān)聯(lián)?,F(xiàn)代研究表明,槲皮素具有抑制炎癥、血小板聚集和血管平滑肌細胞增殖的作用,通過抗氧化作用誘導(dǎo)細胞凋亡,還可通過雌激素受體,調(diào)控受體下游多種底物及信號通路而調(diào)節(jié)雌激素[6-7]。木犀草素與41 種EM 靶點相關(guān)聯(lián),具有抗炎、抗纖維化、抑制血管生成等作用[8]。EM發(fā)生發(fā)展過程中慢性炎癥反應(yīng)一直貫穿始終,且存在纖維化病變,木犀草素或在EM 治療中有一定作用[9-10]。

        圖3 119 個節(jié)點 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

        表2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點

        通過VENE 圖,發(fā)現(xiàn)七味中藥共有作用靶點19 個,部分共有靶點與Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)圖以及PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點高度對應(yīng),進一步強調(diào)了該部分共有靶點在EM 中的作用。如PTGS2,該靶點所調(diào)控環(huán)氧合酶(COX-2)的高表達會導(dǎo)致細胞的高增殖性、高侵襲性,誘導(dǎo)血管生成從而加重EM 的疼痛和不孕癥狀[11]。NCOA2、NCOA1 的水平異常與EM 的進展關(guān)聯(lián)密切。趨化因子參與子宮內(nèi)膜異位種植過程中趨化、黏附、侵襲、血管形成及細胞生長分化等多個重要環(huán)節(jié)[12]。Xiu 等發(fā)現(xiàn),在分泌期,NCOA1 和趨化因子CXCL12 在異位子宮內(nèi)膜中的表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜;活化血小板對異位內(nèi)膜具有促炎、促血管生成的作用,促使異位內(nèi)膜細胞的侵襲和增殖[13-14],子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可分泌F2,以密集依賴的方式誘導(dǎo)血小板活化和聚集,從而影響EM 的進展[15-16]。VEGFA 可促進新生血管形成并使血管通透性增加,陳曉莉等[17]研究表明,內(nèi)異癥組血清和腹腔液VEGF 水平明顯高于對照組,且重度患者腹腔液中VEGF 水平高于輕度患者,VEGF 在EMT 患者血管生成中起促進性作用,在血清與腹腔液中的高表達與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。尉偉東等[18]發(fā)現(xiàn)CASP3 蛋白在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的評分明顯低于正常對照組,caspase-3 的水平下降提示內(nèi)膜細胞活性下降,促使子宮內(nèi)膜細胞自發(fā)性凋亡增加以及凋亡信號敏感性增強,誘導(dǎo)或加重EM。

        利用KEGG 數(shù)據(jù)庫,找到了七味活血化瘀藥共有EM 相關(guān)通路19 條,涉及性激素、炎癥、細胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中,炎癥通路達到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF 三條信號通路是靶點富集最多的通路,提示活血化瘀藥主要通過抗炎作用來對EM 起治療作用。與正常女性相比,EM 患者的子宮內(nèi)膜在位和異位內(nèi)膜細胞的PI3K 表達增加,AKT 磷酸化水平升高,證實PI3K/AKT 信號通路可影響 EM 進展[19]。EM 是一種雌激素依賴性疾病,呈現(xiàn)出慢性炎癥反應(yīng),多種炎性因子參與其病理過程,包括 NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17 等[20]。許麗華等[21]通過實驗發(fā)現(xiàn),EM 患者血清及腹腔液中TNF-α 水平顯著高于對照組。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α 水平均高于Ⅰ和Ⅱ期,證實了TNF-α 與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有助于子宮內(nèi)膜異位癥的診斷。IL-1 家族在EM 發(fā)生發(fā)展中作用顯著,與正常女性相比,EM 患者靜脈血中IL-1β 濃度顯著增高。不僅僅是 IL-1β,研究顯示,IL-1β 前體蛋白(proIL-1β)也可以加重炎癥反應(yīng),EM 患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β 水平均高于健康女性。IL-1 家族細胞因子的損傷,導(dǎo)致EM 患者腹腔免疫機制的紊亂,局部以及全身IL-1β、IL-18 調(diào)控機制的缺陷,使得內(nèi)膜組織的侵襲性以及生長性大幅增加,從而導(dǎo)致EM[22-24]。炎癥相關(guān)通路的高富集也與之前網(wǎng)絡(luò)圖中TNF、IL-6 等炎性相關(guān)靶點的高度值相對應(yīng),進一步強調(diào)了活血化瘀藥物通過抗炎作用治療EM 的作用機制。細胞凋亡是一種獨特的程序性細胞死亡,細胞的有效清除而不會引起炎癥反應(yīng),EM 特征為異位內(nèi)膜細胞凋亡率下降。與健康女性子宮內(nèi)膜相比,EM 異位內(nèi)膜抗凋亡因子表達增加,促凋亡因子表達減少,證實了細胞凋亡在EM 的發(fā)病中確有作用,并和炎癥反應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)[25]。EM 發(fā)生發(fā)展過程中亦伴隨著血管生成增多以及局部病灶周期性出血,EM 患者異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達量增高,抗血管生成因子(sFlt-1) 表達量下降,證實VEGF 信號通路、血小板激活通路均參與此過程,與前面靶點分析也形成呼應(yīng)[26-27]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是各種慢性疾病中慢性疼痛形成和維持的調(diào)節(jié)因子,EM 伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度明顯高于無疼痛EM 患者[28]。利用KEGG 通路分析,可以發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥對于炎癥、凋亡、疼痛、血管生成等相關(guān)通路均具備調(diào)控作用,進一步強調(diào)了臨床上活血化瘀藥對于EM 的治療價值。

        表3 七味活血化瘀中藥的 19 條 KEGG 通路

        圖4 七味活血化瘀中藥 KEGG 信號通路熱圖

        綜上所述,活血化瘀中藥可通過多靶點、多通路協(xié)同作用方式對EM 進行治療,體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病特色。上述七味中藥中,桃仁、澤蘭對于EM 的作用低于其余活血化瘀藥,而紅花、益母草在EM 治療體系中,EM 相關(guān)靶點高于其余中藥,可能會起到更好的療效,在臨床上可嘗試推廣使用。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā),根據(jù)活血化瘀中藥有效成分和作用靶點,在一定程度上對活血化瘀中藥治療EM 進行了機制的解析,為指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的依據(jù)。但本研究僅僅基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫,利用計算機軟件從理論上對活血化瘀中藥治療EM 作用機制做了探析,還需要通過實驗和臨床實踐來進一步證實,而且還需要擴大活血化瘀藥物探究范圍,結(jié)合臨床實際,深入剖析活血化瘀藥共同點與差異之處。

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