仇雷雷，王 博，鄒帥軍，王倩倩，張黎明 （海軍軍醫(yī)大學海軍特色醫(yī)學中心海洋生物醫(yī)藥與極地醫(yī)學研究室，上海200433）

0 引言

膠原蛋白主要存在于動物皮膚、骨骼和結(jié)締組織中，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。膠原蛋白具有較低的免疫原性、較好的生物相容性、良好的生物降解性等生物學優(yōu)點，廣泛應用于生物制藥、醫(yī)療保健、組織工程、食品加工、美容化妝品等領(lǐng)域。目前膠原蛋白主要來源于陸生牲畜（牛、羊和豬等），但某些疾?。谔阋?、瘋牛?。┮约白诮滔嚓P(guān)問題，使得這些牲畜來源的膠原蛋白應用受到一定約束[1]。海洋來源的膠原蛋白資源豐富，且不存在傳染性病菌和倫理等問題，因而，對海洋生物來源的膠原蛋白進行開發(fā)利用具有良好的應用前景[2]。

目前，從海洋生物提取膠原蛋白的研究主要集中在鱈魚、羅非魚、海參以及水母等，這些海洋生物的皮膚、肌肉、軟骨組織及中膠層等部位中含有豐富的膠原蛋白[3]。水母是一類膠質(zhì)狀的浮游生物，屬刺胞動物門，種類多，分布廣，我國近海海域水母資源豐富。大型水母傘部直徑可達2 m，中膠層非常厚實，其中膠原蛋白（122.64～693.92 mg/g，干重）約占總蛋白含量的50%[4]。本研究選用青島海域采集的越前水母（Nemopilema nomurai），對其傘部膠原蛋白進行分離純化和表征，為水母膠原蛋白的開發(fā)應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

SCIENTZ-12N 冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LA8080 氨基酸自動分析儀（日本株式會社日立高新技術(shù)科學）；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Scientific 公司）；X′Pert3 Powder X 射線衍射儀（荷蘭帕納科公司）；VARIOSKAN LUX 多功能酶標儀（美國Thermo Scientific 公 司）；Mini-PROTEAN Tetra System 垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）。

1.2 試劑

越前水母樣品采集于青島海域，腌制后于-20 ℃保存；牛I 型膠原蛋白標準品（河北考力森公司）；胃蛋白酶（上海生工生物工程公司）；標準蛋白Marker（日本TaKaRa 公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 膠原蛋白的提取與純化

提取：經(jīng)腌制的水母樣品用自來水清洗，去除表面鹽分，4 ℃下用去離子水浸泡、洗凈后，再用異丙醇去除脂肪、NaOH 去除雜蛋白、過氧化氫去除色素。稱取去雜水母傘蓋樣品，組織勻漿后加入相應體積不同濃度（0.3～0.6 mol/L）的乙酸溶液，胃蛋白酶的添加量為水母傘蓋質(zhì)量的0.1%～0.5%，酶消化時間為24～96 h，反應后的液體使用200 目網(wǎng)過濾，離心（4 ℃，10 000 r/min）30 min 取上清即得粗提液。

純化：①超濾：分別取粗提液5 ml 至分子量10 萬和 5 萬的超濾管中，4 ℃ 離心（4 000 r/min，30 min），收集濾液進行SDS-PAGE 分析。②透析：分別取粗提液5 ml 到分子量5 萬和10 萬的透析袋中，4 ℃透析3 d，每8 h 換一次透析液，取樣進行電泳分析。③鹽析：取粗提液5 ml，添加NaCl 至濃度為 0.9 mol/L，4 ℃ 下 10 000 r/min 離心 10 min，收集沉淀，復溶于0.5 mol/L 乙酸溶液，重復上述過程2 次，取溶液進行電泳分析。僅改變NaCl 濃度（0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L 或 2.0 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L），重復實驗。

粗提液純化后，在-80 ℃冷凍干燥得水母酶溶性膠原蛋白（PSC）。

2.2 單因素分析和正交實驗設(shè)計

以水母膠原蛋白得率（凍干膠原蛋白質(zhì)量/水母干重）為指標，確定基本反應條件（乙酸濃度、料液比、胃蛋白酶用量、提取時間），每次改變其中一個條件進行水母膠原蛋白提取的單因素實驗。

獲得單因素數(shù)據(jù)后，設(shè)計正交實驗（表1）來獲取最佳的實驗方案。

表1 水母膠原蛋白提取正交實驗因素水平表

2.3 天狼星紅法測定膠原蛋白濃度

參照Coentro 等[5]的方法檢測膠原蛋白濃度，將100 μl 膠原蛋白溶液添加至1 ml 天狼星紅色染料中靜置30 min，然后以12 000 r/min 離心30 min。去除上清，沉淀用堿性試劑溶解30 min，取200 μl膠原蛋白液于540 nm 處讀數(shù)。

2.4 X 射線衍射

用X 射線衍射儀分析膠原蛋白樣品的晶體結(jié)構(gòu)，X 射線源為 Cu 靶 Ka 輻射（λ=0.154 nm），電流為 40 mA，電壓為 40 kV。掃描角度 2θ 為 5°～40°，掃描速率為 3.6°/min，并根據(jù)公式 λ=2d sinθ，計算d 值。

2.5 紫外光譜分析

膠原蛋白溶解于0.5 mol/L 乙酸中，用多功能酶標儀檢測其紫外光譜。掃描波段為200～400 nm，波長間隔為1 nm。以0.5 mol/L 乙酸溶液作為空白對照。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

取膠原蛋白5 mg 和適量KBr 置于研缽中，研磨均勻。取適量的混合樣品于壓片磨具中，用壓片機制成試樣薄片。將壓片放入傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi)進行掃描（500～4 000 cm-1，分辨率 2 cm-1）。

2.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

膠原蛋白溶液和上樣緩沖液混勻后水?。?00 ℃）加熱 5 min，取 15 μl 上樣，使用 8% 的分離膠和5%的濃縮膠，80 V 電泳100 min。

2.8 氨基酸組成分析

膠原蛋白樣品在110 ℃下鹽酸水解24 h，水解產(chǎn)物12 000 r/min 離心20 min，上清液用氨基酸自動分析儀進行氨基酸含量測定。

本文采用MIDAS-GTSNX巖土有限元軟件來模擬雙排水盲溝的滲流計算。一般計算模型如圖2所示。計算時，在模型兩側(cè)以及排水盲溝處設(shè)置給定水頭邊界；在模型底面、頂面，以及排水盲溝上的開挖面設(shè)置給定流量邊界，流量為0，即為隔水邊界。

2.9 膠原蛋白的溶解性

將膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L 乙酸溶液中，配成1 mg/ml 的膠原蛋白溶液，分別取10 ml 溶液調(diào)配成不同 pH 值（3～9 共 7 個梯度）和 NaCl 濃度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mol/L），10 000 r/min離心，取上清液進行膠原蛋白濃度測定，并繪制變化曲線。

2.10 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 膠原蛋白提取的單因素結(jié)果

從圖1A 可見，當酶的用量從0.1%升到0.3%時，膠原蛋白得率逐漸增高并達到最大值。繼續(xù)增加酶使用量，膠原蛋白得率反而減少，可能是過量酶對膠原蛋白具有一定破壞作用。從圖1B 可見，當乙酸濃度為0.4 mol/L 時，膠原蛋白的得率最高。而乙酸過量，會破壞已生成膠原蛋白。從圖1C可見，料液比在1∶2 g/ml 時，水母膠原蛋白的得率最大?？赡苁橇弦罕鹊陀?∶2 g/ml 時，膠原溶脹不充分，而料液比繼續(xù)增加并沒有多余膠原以供溶脹。從圖1D 可見，隨著時間推移，膠原蛋白的得率先升高再下降：48 h 和24 h 相比，增加了8.8%；72 h和 48 h 相比，增加了 15.9%；96 h 和 72 h 相比，得率反而下降，說明72 h 是膠原蛋白提取的最佳時間點。

3.2 膠原蛋白提取的正交實驗

表 2 正交實驗極差 R 分析中，RA＞RD＞RC＞RB，即在膠原蛋白提取中，酶的使用量起著最關(guān)鍵的作用，提取時間排第二，料液比和乙酸濃度的影響比較小。綜合這9 組數(shù)據(jù)，確定最優(yōu)理論水平為A3B2C2D3，即乙酸（0.4 mol/L）、料液比（1∶2 g/ml）、胃蛋白酶（0.3%），提取 72 h，此時的得率為（33±0.63）%。

3.3 膠原蛋白的純化

圖2 中水母膠原蛋白粗提物（泳道8）在分子量13 萬處含有大量的目標膠原蛋白，分子量10 萬以下有雜條帶。不同規(guī)格透析袋處理（泳道1、2）后，分子量10 萬以下的雜蛋白部分去除；鹽析結(jié)果顯示，0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L NaCl 的鹽析（泳道4）可以去除大量雜蛋白，但目標蛋白損失較多，而 0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl（泳道3）處理既可以保留目標蛋白又能夠去除部分雜蛋白。最后超濾結(jié)果顯示，分子量10 萬（泳道6）的超濾管可以明顯減少雜蛋白含量。

3.4 SDS-PAGE 電泳分析

圖1 水母膠原蛋白提取的單因素分析

表2 水母膠原蛋白提取正交實驗結(jié)果

圖2 水母膠原蛋白純化過程 SDS-PAGE 電泳圖

純化實驗結(jié)果提示，單一純化方法不能完全去除雜蛋白，傳統(tǒng)透析處理耗時長，而反復鹽析會增加膠原蛋白溶液NaCl 含量。綜合權(quán)衡后確定純化條件為0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl 鹽析和100 kDa 超濾組合。圖3 是組合純化后膠原蛋白電泳圖：泳道b 為牛I 型膠原蛋白標準品，在分子量 13 萬左右有 α1、α2鏈，而 β 鏈 γ 鏈的分子量都在20 萬以上。本實驗提取的水母膠原蛋白（泳道a），分子量10 萬下基本沒有雜蛋白，但α 鏈只發(fā)現(xiàn)了一條，其分子可能是(α1)3[6-7]，分子量在13 萬左右，符合I 型膠原蛋白的特征。

圖3 純化后水母膠原蛋白 SDS-PAGE 電泳圖

3.5 膠原蛋白的X 射線衍射圖

膠原蛋白X 射線衍射分析結(jié)果如圖4、表3 所示。水母膠原蛋白和牛膠原蛋白都有3 個衍射峰。峰1 形狀尖銳與膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，d 值反映膠原蛋白分子鏈間距離[8]，水母和牛膠原蛋白的d1值分別為 1.244 nm 和 1.226 nm。在20°附近出現(xiàn)一個寬大峰（峰2），代表膠原蛋白纖維內(nèi)部眾多結(jié)構(gòu)層次所引起的漫散射[9]。在30°附近出現(xiàn)了第3 個峰（峰3），該峰較小，其d 值顯示三股螺旋結(jié)構(gòu)中沿螺旋中心軸相鄰氨基酸殘基之間的距離[10]，水母和牛膠原蛋白峰3 的d3值分別為0.295 nm 和0.296 nm，極為接近。說明水母膠原蛋白和牛膠原蛋白標準品一樣，保持了完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

3.6 膠原蛋白的紫外吸收光譜

蛋白通常含有芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，這些氨基酸含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，在特定波長（280 nm 和251 nm）處有最大吸收峰。但在膠原蛋白中這些氨基酸含量少，其紫外吸收峰主要集中在220～230 nm，主要是由羰基C=O 的n→π躍遷所致。水母膠原蛋白的紫外光譜如圖5 所示，其最強吸收峰在220 nm 處，與牛膠原蛋白吸收峰出現(xiàn)的位置類似，接近Ab Aziz 等[11]報道的水母Rhopilema hispidum 膠原蛋白紫外吸收峰（218 nm），提示本實驗中提取的水母膠原蛋白純度較高。

3.7 膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜

圖4 膠原蛋白的 X 射線衍射圖譜

表3 膠原蛋白 X 射線衍射峰對應的 d 值

從圖6 可見，水母膠原蛋白酰胺A 吸收峰為3 288 cm-1，和 Rastian 等[12]檢測的酰胺 A（3 292 cm-1）吸收峰接近，表明氫鍵存在于膠原蛋白結(jié)構(gòu)中。膠原蛋白分子中CH2基團的不對稱伸縮振動產(chǎn)生了酰胺B 特征吸收峰[13-14]，水母膠原蛋白的酰胺B 在2 933 cm-1處，和牛膠原蛋白的酰胺 B（2 936 cm-1）吸收峰類似。作為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的特征區(qū)域——酰胺Ⅰ帶（1 625～1 690 cm-1），是由蛋白質(zhì)肽鏈骨架的C=O 伸縮振動產(chǎn)生[15]，水母膠原蛋白的酰胺I 帶出現(xiàn)在1 641 cm-1。水母膠原蛋白酰胺II 帶吸收峰出現(xiàn)在1 543 cm-1，在膠原蛋白酰胺II 帶（1 500～1 600 cm-1）的范圍內(nèi)，可能是 C—N 鍵的伸縮振動和N—H 彎曲振動產(chǎn)生。水母膠原蛋白酰胺Ш位于1 236 cm-1處，主要是脯氨酸側(cè)鏈和甘氨酸骨架的—CH2搖擺振動產(chǎn)生，提示所提取的水母膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)完整性較好。

圖6 膠原蛋白的紅外光譜

圖5 膠原蛋白紫外光譜

3.8 天狼星紅法檢測膠原蛋白

電泳圖譜表明提取的水母膠原蛋白達到電泳純（95%）。文獻報道[16-18]天狼星紅染料與膠原蛋白中的特征性結(jié)構(gòu)Gly-X-Y 結(jié)合，可以使用天狼星紅染料對膠原蛋白進行快速檢測。本實驗測得每100 mg 凍干的水母膠原蛋白樣品中含有膠原蛋白96.85 mg，其純度為96.85%。

3.9 氨基酸組成分析

如表4 所示，水母膠原蛋白的氨基酸組成中，甘氨酸占34.8%，與云南深水鯛魚皮膠原蛋白甘氨酸含量（35%）接近，比熱帶淡水鯉魚鱗中膠原蛋白甘氨酸含量（30.6%）高[19]。水母的膠原蛋白中羥脯氨酸占6.3%，脯氨酸占8.2%，亞氨酸比例為14.5%。其脯氨酸羥基化度（羥脯氨酸含量/亞氨酸含量）為43.68%，比牛膠原蛋白標準品的羥基化度（39.92%）和Zhang 等[7]提取的水母膠原蛋白的羥基化度（32.2%）都高。據(jù)文獻報道[20]，羥基化度越高，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。檢測結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)蛋氨酸、酪氨酸和組氨酸的含量比較低，缺乏色氨酸，這些都符合I 型膠原蛋白的特點[21]。

3.10 膠原蛋白的溶解性

從圖7A 可見，當NaCl 濃度在0.5～0.8 mol/L時，水母膠原蛋白相對溶解度比較穩(wěn)定，保持著最大值。其原因可能是低濃度的鹽離子可以與膠原蛋白分子結(jié)合，使得膠原蛋白分子帶有更多的電荷，相互排斥，溶解度較大。當NaCl 濃度達到0.9 mol/L時，水母膠原蛋白的溶解度急劇下降，相對溶解度不到23%，當NaCl 濃度超過1.0 mol/L 后，其相對溶解度在15%左右?？赡芤驗镹aCl 的濃度較高時，極性較強的鹽離子奪走了膠原蛋白結(jié)合的水分子，破壞了其周圍的水化膜，鹽析作用顯現(xiàn)出來，溶解度下降。

表4 二種膠原蛋白中不同氨基酸組分的百分比

從圖7B 可見，當溶液的pH 在3～5 時，水母膠原蛋白的相對溶解度比較大，維持在80%左右。其中pH 為4 時，溶解度最大，與海參膠原蛋白的溶解性類似[3]。當pH 在6～8 時，膠原蛋白的相對溶解度維持在較低值，尤以pH 7 時溶解度最小，此時就是膠原蛋白的等電點。當pH 超過8 后，膠原蛋白溶液的溶解度又有所上升。

4 討論

圖7 水母膠原蛋白在不同 pH 值及NaCl 濃度條件下溶解度特性

本實驗通過單因素分析和正交實驗優(yōu)化了水母膠原蛋白的提取條件，確定最適條件為：乙酸0.4 mol/L、料液比1∶2 g/mL、胃蛋白酶0.3%、反應72 h。水母膠原蛋白的純化方法優(yōu)化為0.9 mol/L-0.9 mol/L-0.9 mol/L NaCl 鹽析和分子量10 萬超濾的組合方法。相比陽離子交換層析法和Sephacryl S-100 凝膠過濾純化方法，超濾不僅可以去除鹽分和雜蛋白，還能快速富集膠原蛋白，縮短提取時間。

純化的水母膠原蛋白通過天狼星紅法檢測其純度為97%，高于從其他多種海洋生物提取的I 型膠原蛋白純度[22-23]。本實驗中越前水母膠原蛋白干重得率為33% 左右，相比于水母Chrysaora quinquecirrha 膠原蛋白提取得率（1.2%干重）顯著提高[24]。凝膠電泳顯示提取的水母膠原蛋白構(gòu)型可能是 (α1)3，α1鏈分子量約為 13 萬和 10 萬以下基本沒有雜條帶，比Jankangram 等[25]提取的水母膠原蛋白純度更高。在氨基酸組成分析中，越前水母膠原蛋白甘氨酸占34.82%，羥脯氨酸占6.33%，脯氨酸占8.16%，沒有檢測到色氨酸。以上結(jié)果均表明水母膠原蛋白符合I 型膠原蛋白的特點。光譜分析發(fā)現(xiàn)，分離純化過程中水母膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保存較好。溶解度試驗表明其在pH=4 時溶解性最佳，當NaCl 濃度升高至0.9 mol/L 時溶解度快速下降。

總之，本研究通過優(yōu)化提取純化過程，縮短了水母膠原蛋白制備時間，提高了所得膠原蛋白的純度，且水母膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整，與牛I 型膠原蛋白特征相似度很高，提示水母膠原蛋白可望成為哺乳動物膠原蛋白的替代品。鑒于水母膠原蛋白具有資源豐富、提取方便、生物相容性好等優(yōu)點，可望成為生物醫(yī)藥、食品、化妝品等多領(lǐng)域的理想生物材料，具有良好的應用前景。