張 澤，裴 鑫，魯儀增，常金財，鄭 健，①

(1. 北京農學院園林學院，北京 102206； 2. 山東省林木種質資源中心，山東 濟南 250102；3. 呼倫貝爾市林業(yè)科學研究所，內蒙古 呼倫貝爾 021008)

小熱激蛋白(sHSPs)是理論相對分子質量介于16 000～40 000之間的一類熱激蛋白，是植物中最豐富且分布廣泛的一類熱激蛋白，且相較于其他真核生物，數(shù)目更多，差異也較大[1]。小熱激蛋白不僅參與許多細胞內過程及某些蛋白質家族成員突變導致細胞功能紊亂的調節(jié)[2-3]，還能在脅迫下作為中間體，通過阻止蛋白質的不可逆變性保護蛋白質。同時，小熱激蛋白不僅起著“保持酶”伴侶的作用，還積極調控蛋白質富集過程，提高細胞在不同應激條件下(如高溫或氧化應激)恢復蛋白質穩(wěn)態(tài)的能力。除了調節(jié)細胞應激反應和響應細胞條件的變化，許多小熱激蛋白基因還能在正常生長的細胞中表達[4-5]，通過調節(jié)正常蛋白質間的相互作用影響多種細胞功能，包括細胞信號傳導、分化和凋亡。研究表明：小熱激蛋白不僅參與植物對高溫或熱激的響應，而且能響應其他生物及非生物脅迫，如病原菌、捕食者、干旱、低溫、鹽害、紫外線、重金屬離子、滲透脅迫、厭氧脅迫甚至是重力的變化等，也能誘導小熱激蛋白基因表達[6]。高溫脅迫下，F(xiàn)estucaarundinaceaSchreb.中FaHSP18.2基因的表達量明顯上調，進而提高其對高溫的耐受性[7]；干旱脅迫處理后，EucalyptuscladocalyxF. Muell.中EcHSP17.6基因表達量極顯著升高[8]；馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)中大多數(shù)小熱激蛋白基因在高溫脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫下明顯上調表達[9]；水稻(OryzasativaLinn.)中OsHSP26.7、OsHSP23.2、OsHSP17.9A、OsHSP17.4和OsHSP16.9A基因在熱脅迫下上調表達[10]；橡膠樹〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕在低溫脅迫條件下大多數(shù)小熱激蛋白基因明顯上調表達[11]。然而，小葉楊(PopulussimoniiCarr.)中PsHSP17.4基因在高溫脅迫下轉錄下調，推測其可能在小葉楊高溫脅迫過程中不作為分子伴侶，而是發(fā)揮了其他功能[12]。此外，小熱激蛋白還能參與植物特定的生長發(fā)育過程[13]。

花楸樹〔Sorbuspohuashanensis(Hance) Hedl.〕為落葉小喬木，廣泛分布于中國北方地區(qū)，原生境海拔約800～2 500 m，是一種優(yōu)良的觀葉、觀花、觀果樹種，在中國東北地區(qū)作為行道樹適應性良好[14]。除觀賞價值外，花楸樹還是中國傳統(tǒng)的藥用植物[15-16]。已有關于花楸樹的研究主要集中在地理分布與天然更新[17]、群體遺傳多樣性[18]、種源地理變異[19]、種子發(fā)育與休眠[20-21]、繁殖技術[22-23]以及引種馴化[24]等方面，而在花楸樹響應高溫脅迫的機制方面，僅有花楸樹2年生幼苗響應高溫脅迫的生理生化機制[25-26]以及花楸樹熱激蛋白70基因克隆和功能[27]方面的初步報道?；ㄩ睒渥匀簧澈０屋^高，土壤大多為山地棕壤，pH 5.4至pH 6.2，呈弱酸性，腐殖質含量高，養(yǎng)分豐富，土壤肥力高。在實際引種馴化及種質資源保存過程中，難以保證引種地(或保存地)與原生地環(huán)境完全一致，因此，花楸樹引種到低海拔地區(qū)將面臨包括高溫在內的多種非生物脅迫限制，探究其對逆境脅迫的響應有助于研究其馴化適應機制。本研究克隆了花楸樹小熱激蛋白基因，探討其在非生物脅迫條件下的表達模式，并通過轉化擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕對其功能進行進一步剖析，明確其在高溫等非生物脅迫下的響應表達模式，以期為花楸樹引種馴化奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗于2017年3月至2019年5月在北京農學院園林學院實驗基地進行。供試花楸樹1年生實生苗(營養(yǎng)缽栽)用于干旱和NaCl脅迫實驗，2年生實生苗(盆栽)用于高溫脅迫實驗，4年生實生苗用于基因組DNA提取和組織特異性表達分析。野生型擬南芥(Col背景)為本實驗室保存。

實驗用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker、pTOPO-TA Simple克隆載體及EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物技術有限公司，EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit、50×TAE Buffer、2×Sybr Green qPCR Mix和抗生素等化學試劑購自北京艾德萊生物技術有限公司。Pleela超表達載體由中國科學院植物研究所劉永秀課題組惠贈。引物合成及測序皆由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第1鏈合成 參照劉聰聰?shù)萚27]的方法進行花楸樹葉片基因組DNA的提取，參照EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit說明書進行總RNA的提取，參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書進行反轉錄，合成cDNA第1鏈。

1.2.2 基因克隆和序列分析 對花楸樹轉錄組數(shù)據(jù)[28]進行分析后，經NCBI的BLAST網站(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中BLASTn在線軟件比對，獲得1條與小熱激蛋白基因相似的序列，依據(jù)所得序列設計引物SpHSP23.8-CF和SpHSP23.8-CR(表1)，分別以花楸樹cDNA和gDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為20.0 μL，包括模板1.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10.0 μL和ddH2O 8.2 μL。擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經質量體積分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶、連接到pTOPO-TA Simple克隆載體進行測序，采用DNAMAN 7.0軟件對測序結果進行開放閱讀框(open reading frame，ORF)分析，獲得該基因的cDNA序列，然后對該基因的gDNA和cDNA進行序列比對和結構分析。

1.2.3 蛋白質生物信息學分析 使用DNAMAN 7.0軟件預測花楸樹SpHSP23.8基因編碼的氨基酸序列，利用NCBI的BLAST網站中BLASTp在線軟件進行同源性比對；利用ExPasy網站(http：∥www.expasy.org/)的相關軟件預測蛋白質的理論等電點和理論相對分子質量；通過ProtParam工具(https：∥web.expasy.org/protparam/)對蛋白質的一級結構進行分析；利用Sopma工具(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質的二級結構；利用ClustalX 2.1軟件對花楸樹SpHSP23.8蛋白以及擬南芥、水稻和毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et A. Gray ex Hook.)等模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進行聚類分析(鄰接法，neighbor joining method)，并采用自檢舉法(bootstrap method)對構建的進化樹進行評估(重復1 000次)。

表1 用于花楸樹SpHSP23.8基因克隆和表達的引物序列

1.2.4 基因表達分析

1.2.4.1 組織特異性表達分析 參照劉聰聰?shù)萚27]的研究方法，選取3株花楸樹4年生實生苗，分別于2018年3月10日取芽，3月20日取幼葉和莖(1年生枝條的頂部第1和第2節(jié)間部分)，4月20日(盛花期)取花，5月20日(花期后20 d)取果實、成熟葉和根，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。每株作為1個生物學重復，重復3次。

1.2.4.2 響應高溫脅迫表達分析 以花楸樹2年生實生苗為實驗材料，置于晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時間16 h·d-1、光照強度300 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中預處理3 d后，進行溫度42 ℃、全光照、光照強度300 μmol·m-2·s-1熱激脅迫處理，期間正常澆灌清水避免干旱，分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對照。每個處理3株，重復3次。

1.2.4.3 響應NaCl脅迫表達分析 以花楸樹1年生實生苗為實驗材料，在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時間16 h·d-1、光照強度300 μmol·m·s-1的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，分別澆灌200和300 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，分別于處理2和7 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以澆灌等體積蒸餾水為對照。每個處理10株，重復3次。

1.2.4.4 響應干旱脅迫表達分析 以花楸樹1年生實生苗為實驗材料，在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時間16 h·d-1、光照強度300 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別于干旱脅迫(不澆灌清水)處理5和10 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以正常澆灌清水為對照。每個處理10株，重復3次。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1)，均以花楸樹β-actin基因為內參基因，引物為Spβ-actinQF和Spβ-actinQR(表1)，PCR反應體系參照2×Sybr Green qPCR Mix說明書。PCR反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。

1.2.5 轉SpHSP23.8基因擬南芥響應非生物脅迫的表達分析

采用Gateway方法[29]，構建SpHSP23.8-Pella(35S驅動)超表達載體，并將其轉化農桿菌GV3101+MPK90，利用農桿菌介導轉化野生型擬南芥。在含有100 μg·mL-1草銨膦(PPT)的固體MS培養(yǎng)基上篩選轉基因植株，經3代篩選獲得2個超表達純合轉SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2，用于后續(xù)試驗。載體構建使用的引物為SpHSP23.8-TF和SpHSP23.8-TR(表1)。

1.2.5.1 轉SpHSP23.8基因擬南芥響應高溫脅迫表達分析 以4周齡OE1和OE2為實驗材料，將其置于溫度42 ℃、全光照、光照強度150 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中，分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h取蓮座葉片(處理期間正常澆灌清水)，經液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對照。每個基因型每個處理收集3株，重復3次。

1.2.5.2 轉SpHSP23.8基因擬南芥響應NaCl脅迫表達分析 以4周齡OE1和OE2為實驗材料，在晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照時間16 h·d-1、光照強度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別澆灌150 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，每3 d澆灌1次，分別于處理0、3、6和9 d取蓮座葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以處理0 d為對照。每個基因型每個處理收集3株，重復3次。

1.2.5.3 轉SpHSP23.8基因擬南芥響應干旱脅迫表達分析 以4周齡OE1和OE2為實驗材料，在光照時間16 h·d-1、晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照強度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別于干旱脅迫(不澆灌清水)0、3、6和9 d取蓮座葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以干旱脅迫0 d為對照。每個基因型每個處理收集3株，重復3次。

qRT-PCR分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1)，以擬南芥β-actin基因為內參基因，引物為Atβ-actinQF和Atβ-actinQR(表1)，參照2×Sybr Green qPCR Mix說明書進行qRT-PCR分析，PCR反應程序同1.2.4.4，每個樣品3個技術重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定量結果采用2-ΔΔCT方法[30]進行計算。采用SPSS 15.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較[31]。

2 結果和分析

2.1 花楸樹小熱激蛋白基因cDNA和gDNA序列分析

根據(jù)花楸樹轉錄組數(shù)據(jù)，以花楸樹cDNA為模板進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和測序，獲得1條長度為648 bp的片段(圖1)，經與其他植物比對，發(fā)現(xiàn)該片段為花楸樹小熱激蛋白20家族基因。將PCR產物純化并成功連入pTOPO-TA Simple克隆載體，測序結果經NCBI比對后，確定克隆得到的序列為小熱激蛋白20基因的ORF序列，該序列共包含648個堿基，編碼215個氨基酸，編碼氨基酸序列理論相對分子質量約23 800，該基因命名為SpHSP23.8(圖2)。以花楸樹gDNA為模板的PCR產物堿基序列與SpHSP23.8基因ORF堿基序列比較，發(fā)現(xiàn)該基因gDNA序列共包含953個堿基，在238至633位點插入1個長度為305 bp的內含子(圖1-B)。

M： Marker； 1，2： 分別為SpHSP23.8基因的cDNA和gDNA的PCR擴增條帶PCR amplified bands of cDNA and gDNA of SpHSP23.8 gene，respectively； ATG： 起始密碼子Initiation codon； TAG： 終止密碼子Termination codon.

2.2 花楸樹SpHSP23.8蛋白的基本特性

蛋白質一級結構分析結果顯示：花楸樹SpHSP23.8基因編碼215個氨基酸，組成結構為C1034H1685N297O334S7，不穩(wěn)定系數(shù)66.61，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白包含帶負電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)33個，帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)31個(圖2)，理論等電點為pI 5.47，屬于酸性蛋白質。

箭頭示內含子插入位點The arrow shows the insertion site of intron； 方框示小熱激蛋白特有保守序列The boxes show the specific and conserved sequences of small heat shock protein； *： 終止密碼子Termination codon.

蛋白質二級結構的預測結果(圖3)顯示：花楸樹SpHSP23.8蛋白中α螺旋包含50個氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的23.26%；β轉角包含9個氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的4.19%；延伸鏈包含28個氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的13.02%；無規(guī)卷曲包含128個氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的59.53%。

h： α螺旋α-helix； t： β轉角β-turn； e： 延伸鏈Extended strand； c： 無規(guī)卷曲Random coil.

蛋白質磷酸化位點預測結果(圖4)顯示：SpHSP23.8蛋白包含28個磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點23個，蘇氨酸磷酸化位點5個。

： 絲氨酸Serine； ： 酪氨酸Tyrosine； ： 蘇氨酸Threonine； ： 閾值Threshold.

SignalP預測結果(圖5)顯示：Y分值的最大值為0.214，C分值的最大值為0.126，S分值的最大值為0.444，D值(S分值的平均值和Y分值的最大值的平均值)為0.224(小于0.500)，說明SpHSP23.8蛋白不具有信號肽。

： C分值C-score； ： S分值S-score； ： Y分值Y-score； ： 閾值Threshold.

將SpHSP23.8蛋白的氨基酸序列在NCBI網站上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)SpHSP23.8蛋白中ACD序列分別位于119～200位點，其羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L(圖2)。與同源性較高的植物的比對結果(圖6)顯示：SpHSP23.8蛋白與枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕EjsHSP6蛋白(登錄號AKP06201.1)的同源性最高，為94.88%；與白梨(PyrusbretschneideriRehd.)PbsHSP蛋白(登錄號XP_009348586.1)、梅(PrunusmumeSieb.)PmHSP22蛋白(登錄號XP_008238549.1)、桃〔Prunuspersica(Linn.) Batsch〕PpHSP22蛋白(登錄號XP_007209602.1)和歐洲甜櫻桃〔Prunusavium(Linn.) Linn.〕PaHSP22蛋白(登錄號XP_021831941.1)的同源性也較高，分別為93.95%、83.26%、82.33%和81.86%；與月季花(RosachinensisJacq.)RcHSP22蛋白(登錄號XP_024172893.1)、大桉(EucalyptusgrandisW. Mill ex Maiden)EgsHSP蛋白(登錄號XP_010053471.1)、野草莓(FragariavescaLinn.)FvHSP22蛋白(登錄號XP_004299444.1)、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)AcsHSP蛋白(登錄號PSS11530.1)和南瓜(CucurbitamoschataDuch.)CmsHSP蛋白(登錄號XP_022937223.1)的同源性較低，分別為64.94%、64.53%、63.20%、61.09%和61.01%。

Sp： 花楸樹Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl.； Ej： 枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.； Pb： 白梨Pyrus bretschneideri Rehd.； Pm： 梅Prunus mume Sieb.； Pp： 桃Prunus persica (Linn.) Batsch； Pa： 歐洲甜櫻桃Prunus avium (Linn.) Linn.； Rc： 月季花Rosa chinensis Jacq.； Eg： 大桉Eucalyptus grandis W. Mill ex Maiden； Fv： 野草莓Fragaria vesca Linn.； Ac： 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.； Cm： 南瓜Cucurbita moschata Duch.

對花楸樹SpHSP23.8蛋白與擬南芥、水稻和毛果楊3種模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進行聚類分析，結果(圖7)顯示：花楸樹SpHSP23.8蛋白與毛果楊PtHSP24.0蛋白在進化上關系最近，且與毛果楊、擬南芥和水稻線粒體亞族的小熱激蛋白聚為一支，推測SpHSP23.8蛋白定位于花楸樹的線粒體中。

Pt： 毛果楊Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.； At： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Os： 水稻Oryza sativa Linn.； Sp： 花楸樹Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl. CⅠ，CⅡ，CⅢ，CⅣ，CⅤ，CⅥ： 分別為細胞質亞族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ Cytosol subgroup Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，and Ⅵ，respectively； ER： 內質網亞族Endoplasmic reticulum subgroup； PX： 過氧化物酶體亞族Peroxisome subgroup； CP： 葉綠體亞族Chloroplast subgroup； MⅠ，MⅡ： 分別為線粒體亞族Ⅰ和Ⅱ Mitochondria subgroup Ⅰ and Ⅱ，respectively. 分支上數(shù)據(jù)表示重復次數(shù)Datums in the branches indicate repeats.

2.3 花楸樹SpHSP23.8基因的表達分析

花楸樹不同器官中SpHSP23.8基因的表達情況見圖8；高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫下，花楸樹葉片中SpHSP23.8基因的表達情況分別見圖9、圖10和圖11。

YL： 幼葉Young leaf； ML： 成熟葉Mature leaf； B： 芽Bud； Fl： 花Flower； Fr： 果實Fruit； S： 莖Stem； R： 根Root. 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

由圖9可以看出：隨著高溫脅迫時間的延長，花楸樹葉片中SpHSP23.8基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢。高溫脅迫0.25 h，SpHSP23.8基因的相對表達量即顯著升高，隨后急劇升高；高溫脅迫2.00 h，其相對表達量達到峰值，隨后其相對表達量顯著降低。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

由圖10可以看出：200和300 mmol·L-1NaCl脅迫下，花楸樹葉片中SpHSP23.8基因的相對表達量均顯著高于對照(蒸餾水)。NaCl脅迫2 d，SpHSP23.8基因的相對表達量隨著NaCl濃度的提高顯著升高；NaCl脅迫7 d，其相對表達量隨著NaCl濃度的提高先顯著升高后顯著降低。

： 對照The control； ： 200 mmol·L-1 NaCl； ： 300 mmol·L-1 NaCl.

由圖8可以看出：花楸樹莖中SpHSP23.8基因的相對表達量最高，顯著(P<0.05)高于其他器官；果實和根中的相對表達量也較高；花中的相對表達量最低。

由圖11可以看出：干旱脅迫5 d，花楸樹葉片中SpHSP23.8基因的相對表達量與對照(正常澆灌清水)無顯著差異；干旱脅迫10 d，SpHSP23.8基因的相對表達量顯著高于對照。

： 對照The control； ： 干旱處理Drought treatment.

2.4 轉SpHSP23.8基因擬南芥對非生物脅迫響應的表達分析

為進一步探究SpHSP23.8基因響應非生物脅迫的表達模式，構建了SpHSP23.8基因的超表達載體，并轉化野生型擬南芥，通過草銨膦(PPT)篩選獲得超表達純合轉SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2(圖12)。

M： Marker； WT： 野生型擬南芥Wild type of Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

對轉SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2分別進行高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫，結果(圖13)顯示：隨著高溫脅迫時間的延長，轉SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對表達量呈先升高后下降的趨勢，其中，高溫脅迫0.25 h，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對表達量即較對照(高溫脅迫0.00 h)顯著升高；高溫脅迫6.00 h，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對表達量達到峰值；高溫脅迫24.00 h，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對表達量仍顯著高于對照。隨著NaCl脅迫和干旱脅迫時間的延長，轉SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對表達量均呈逐漸升高的變化趨勢，且均較對照(脅迫0 d)顯著升高。上述結果說明：轉SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因能夠被高溫脅迫、NaCl脅迫以及干旱脅迫誘導表達。

： OE1株系OE1 line； ： OE2株系OE2 line.

3 討論和結論

植物小熱激蛋白的高度多樣化以及與穩(wěn)定蛋白結合等特點反映了植物對特定應激條件的適應性，表明小熱激蛋白在植物抗逆性中起重要作用[32]。本研究從花楸樹中分離出1個小熱激蛋白20家族基因SpHSP23.8，該基因的開放閱讀框包含648個堿基，編碼215個氨基酸；SpHSP23.8蛋白氨基酸序列的羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L，進一步證實該基因為花楸樹小熱激蛋白基因[33]。同時，這些保守基序的存在也是小熱激蛋白二聚體形成的前提[34]，推測該小熱激蛋白能夠發(fā)揮分子伴侶的功能。

植物小熱激蛋白中內含子數(shù)量多變，且插入位點也存在較大差異。大多數(shù)小熱激蛋白不含或含有1個內含子，如：馬鈴薯48個小熱激蛋白基因中，20個不含內含子，23個含有1個內含子，5個含有2個及以上內含子[9]；水稻39個小熱激蛋白基因中，19個不含內含子，17個含有1個內含子，3個含有2個及以上內含子[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，一般在內質網、過氧化物酶體以及細胞質Ⅰ和Ⅱ亞族中小熱激蛋白不含內含子，而在葉綠體和線粒體亞族中小熱激蛋白含有1個內含子，且內含子插入位點相似，這些亞族小熱激蛋白具有較近的親緣關系[36]。本研究中，花楸樹SpHSP23.8基因包含1個內含子，該小熱激蛋白屬于線粒體亞族，這一結果進一步論證了含有1個內含子的線粒體亞族小熱激蛋白在進化上的親緣關系較近。

花楸樹SpHSP23.8蛋白二級結構包含23.26%的α螺旋、4.19%的β轉角、13.02%的延伸鏈和59.53%的無規(guī)卷曲，其中，β轉角有助于SpHSP23.8蛋白形成反向平行結構[37-38]，進而發(fā)揮功能。蛋白質磷酸化是蛋白質翻譯后修飾過程中較為重要和普遍的調節(jié)方式之一，SpHSP23.8蛋白包含28個磷酸化位點，分別為23個絲氨酸磷酸化位點和5個蘇氨酸磷酸化位點。該結果進一步說明在非生物脅迫時，SpHSP23.8蛋白在翻譯后可能通過磷酸化修飾發(fā)揮抗性作用[39]。

花楸樹SpHSP23.8基因在花楸樹不同器官中均有表達，表明該基因參與了花楸樹各器官正常的生長發(fā)育。對蘭州百合〔Liliumdavidiivar.willmottiae(E. H. Wilson) Raffill〕小熱激蛋白的研究結果顯示：LimHSP16.45基因在花藥中特異性高表達[40]。而本研究中SpHSP23.8基因在花楸樹花中的相對表達量最低，推測該基因在花的發(fā)育過程中參與較少。對橡膠樹HbHSP23.8基因的組織特異性表達進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在膠乳中的相對表達量最高，且在葉片不同發(fā)育時期也存在明顯差異[41]。茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕4個小熱激蛋白基因在組織中的相對表達量也存在差異，其中，CsHSP22.4和CsHSP27.4基因在葉片中的相對表達量最高，CsHSP17.5和CsHSP25.2基因在莖中的相對表達量最高[42]。本研究中，SpHSP23.8基因在花楸樹莖中的相對表達量最高，其次是果實和根。不同植物小熱激蛋白基因在不同組織中的差異表達也進一步表明小熱激蛋白進化存在差異。

在對花楸樹進行高溫(42 ℃)脅迫的過程中，SpHSP23.8基因的相對表達量呈現(xiàn)先急劇升高后降低的變化趨勢，高溫脅迫0.25 h時SpHSP23.8基因即出現(xiàn)顯著性變化，高溫脅迫2.00 h時SpHSP23.8基因的相對表達量達到峰值。這一結果與大多數(shù)植物小熱激蛋白基因在高溫脅迫下的變化趨勢一致，如：茶樹CsHSP17.2基因表達量在38 ℃下0.5 h出現(xiàn)顯著變化，于1.0 h達到峰值后開始下降[43]；水稻中OsHSP18.2基因的表達量在45 ℃下0.25 h出現(xiàn)顯著變化，于2.00 h達到峰值后開始下降[44]。高溫脅迫下，植物的細胞結構、代謝進程、活性氧和抗氧化物質含量、信號傳導以及滲透調節(jié)物質含量都會產生變化，此時小熱激蛋白寡聚體與底物結合殘基隨著溫度升高而被解離和激活[45]，增強了其分子伴侶活性，起到維持植物體內環(huán)境穩(wěn)定的作用?；ㄩ睒銼pHSP23.8基因在高溫脅迫不同時間的差異表達表明其可能參與了花楸樹對高溫脅迫的應激反應。對轉SpHSP23.8基因擬南芥株系的高溫(42 ℃)脅迫結果亦顯示：轉SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因的相對表達量的變化趨勢與其內源表達趨勢一致，進一步表明SpHSP23.8基因參與了花楸樹對高溫脅迫的響應。

花楸樹原生境土壤偏酸性，低海拔引種地區(qū)土壤的偏堿性可能對其生長發(fā)育帶來一定影響。本研究中，200 mmol·L-1NaCl脅迫2 d，花楸樹SpHSP23.8基因的相對表達量隨NaCl濃度升高而顯著升高，表明SpHSP23.8基因能夠響應NaCl脅迫；而高濃度(300 mmol·L-1)NaCl脅迫7 d，SpHSP23.8基因的相對表達量降低，這可能是由于花楸樹幼苗在高濃度NaCl脅迫下出現(xiàn)萎蔫所致。此外，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對表達量的變化趨勢與其內源表達相一致，進一步表明SpHSP23.8基因能夠響應NaCl脅迫。

干旱脅迫5 d，花楸樹SpHSP23.8基因的相對表達量未出現(xiàn)顯著變化，可能是此時花楸樹尚未受到明顯的干旱脅迫；干旱脅迫10 d，土壤含水量持續(xù)下降，SpHSP23.8基因的相對表達量顯著升高，表明SpHSP23.8基因能夠響應干旱脅迫。此外，在干旱脅迫下，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因相對表達量的變化趨勢與其內源表達相一致，也進一步表明SpHSP23.8基因能夠響應干旱脅迫。

綜上所述，花楸樹SpHSP23.8基因表現(xiàn)出對高溫、干旱及NaCl等非生物脅迫的應激響應，這為揭示SpHSP23.8基因響應非生物脅迫的分子機制奠定了基礎。但與野生型擬南芥相比，2個轉SpHSP23.8基因擬南芥株系未表現(xiàn)出明顯的表型差異。究其原因，一方面，依據(jù)微效多基因假說，推測SpHSP23.8基因的單一超表達不足以提升擬南芥整個抗逆網絡對非生物脅迫的抵抗；另一方面，植物對于非生物脅迫的響應包括感知、傳導和應答等方面，而SpHSP23.8蛋白作為分子伴侶可能需要其他蛋白質或者轉錄因子的協(xié)同參與，因此，轉SpHSP23.8基因擬南芥響應和參與非生物脅迫相關基因的表達還有待進一步的深入研究。