王洪新 王玉社 王 勇△

1)河南省人民醫(yī)院 河南大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003 2)河南省腦血管病醫(yī)院，河南 鄭州 450003

髓母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度最高的神經(jīng)上皮腫瘤之一，容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤中存在具有神經(jīng)干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，它們被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[1-2]。腫瘤干細(xì)胞所處的微環(huán)境包含多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖及定向分化[3-4]。如果改變腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，就可能改變干細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸[5-6]。本次研究通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)以改變腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，觀察其對(duì)腫瘤干細(xì)胞增殖、自我更新和侵襲等方面的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1．1材料人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)購(gòu)自美國(guó)Cell Biologics公司，M199培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞株由美國(guó)American Type Cell Culture提供。CD133抗體購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Notch2抗體購(gòu)自加拿大PLLABS公司，Jagged 1購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Hes-1抗體購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司，Hey-2抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Transwell購(gòu)自Corning公司。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在20%胎牛血清(FBS)和20 mg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。D341髓母細(xì)胞瘤系在加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1．3成球試驗(yàn)將D341Med和HBMECs細(xì)胞放在孔徑0.4 μm的Transwell小室中共培養(yǎng)72 h，在GFP標(biāo)記的D341髓母細(xì)胞瘤系中，用Leica倒置顯微鏡觀察2 000個(gè)細(xì)胞中的成球率，同時(shí)觀察二代和三代的成球率。D341Med單獨(dú)培養(yǎng)作對(duì)照。

1．4流式細(xì)胞儀和細(xì)胞計(jì)數(shù)收集共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，按試劑說(shuō)明，加入1∶200的CD133抗體，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+的細(xì)胞數(shù)。

1．5PCR按TRIzol說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。其中引物由Invitrogen公司合成，Notch2：5′-CCCAATGGGCAAGAAGTCTA-3′ and 5′-CACAATGTGGTGGTGGGATA-3′；Jagged 1：5′-CTCATCAGCCGTGTCTCAAC-3 ′and 5′-GGCACACACACTTAAATCCG-3′；Hes-1：5′-TGGATGCGGAGTCTACGATG-3′and 5′-TAAGGCCACTTGCCACCTTC-3′；Hey-2：5′-ACCTCTCTCTTGTCCCTCTCTG-3′and 5′-GGTTTATTGTTTGTTCCACTGC-3′。

1．6Western雜交試驗(yàn)通過(guò)裂解液提取蛋白，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離生物技術(shù)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，與一抗體兔抗人Notch 2(1∶500)、Jagged 1(1∶500)、Hes-1(1∶500)、Hey-2(1∶500) 4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200)，室溫孵育60 min；TBST洗膜3次后，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑后用成像儀顯影。

1．7Transwell侵襲試驗(yàn)消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用無(wú)血清培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度稀釋為1×105個(gè)/mL，將200 μL細(xì)胞懸液加入到已鋪好Matrigel生物膠的孔徑為8.0 μm Transwell小室內(nèi)，將Transwell小室置于加入500 μL 的含10%胎牛血清培養(yǎng)液的24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，取出小室并用10%甲醛固定30 min，結(jié)晶紫溶液染色30 min，自來(lái)水漂洗30 s后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量。

1．8裸鼠成瘤試驗(yàn)4周齡BALB/c裸鼠，數(shù)字隨機(jī)法分組，各組體質(zhì)量、性別、周齡比例均衡。各組皮下植入腫瘤細(xì)胞(1×105個(gè)/只)，每2天用游標(biāo)法測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度和寬度。40 d后處死小鼠，腫瘤體積按長(zhǎng)度(mm)×寬度2(mm2)/2計(jì)算。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞形成與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組不僅提高了第一代髓母細(xì)胞瘤的成球能力(P<0.05)，而且第二代、第三代的成球能力也明顯提高(P<0.05)(圖1)，CD133+細(xì)胞也顯著增加(P<0.05)(圖2)。

2．2血管內(nèi)皮細(xì)胞激活Notch信號(hào)通路與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組提高了Noch 2、Jagged 1、Hes-1和Hey-2的mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)(圖3)。

2．3Notch信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞的影響通過(guò)加入DAPT，以阻斷Notch信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)CD 133+細(xì)胞減少(P<0.05)(圖2)，伴隨Noch 2、Jagded 1、hes-1和hey-2的表達(dá)下降(P<0.05)(圖3)。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞成球率的影響 A：第一代；B：第二代；C：第三代；*P<0.05Figure 1 Effect of ECs on the stem-like cell phenotype of MB cells in vitro.Sphere-forming assay of primary D341Med (A)，secondary generation D341Med cells (B)，and tertiary generation D341Med cells (C) cultured with or without HBMEC，*P<0.05

圖2 內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)Notch通路對(duì)髓母細(xì)胞瘤CD133+細(xì)胞的影響 D341Med+HBMEC組與D341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05Figure 2 Effect of ECs on MB cell stemness and tumor growth via Notch in vitro.The percentage of CD133-positive cell in D341Med co-cultured with HBMEC with or without DAPT.Compared with the D341Med group，*P<0.05；compared with the D341Med + HBMEC group，#P<0.05

2．4血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激腫瘤細(xì)胞侵襲Transwell侵襲試驗(yàn)顯示D341Med+HBMEC組穿膜細(xì)胞數(shù)319.56±10.67，與D341Med組(197.14±6.85)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與D341Med+HBMEC+DAPT(128.32±3.42)相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．5血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在體內(nèi)建立異種移植瘤模型，D341Med+HBMEC組與D341Med組相比，腫瘤生長(zhǎng)有顯著性差異(P<0.05)；與D341Med+HBMEC+DAPT相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞周圍的微環(huán)境可通過(guò)分泌各種可溶性因子或刺激信號(hào)通路維持細(xì)胞自我更新和分化之間的平衡[7-10]。另外，它還在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用[11-12]。打破這種異常的微環(huán)境就會(huì)削弱或加強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的自我更新，從而抑制或促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[13-14]。

有證據(jù)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞是干細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分[15-16]。ZHU等[17]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中內(nèi)皮細(xì)胞的一項(xiàng)重要功能是創(chuàng)造一個(gè)微環(huán)境，以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新。腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用是腫瘤增生、擴(kuò)散和微轉(zhuǎn)移灶發(fā)展的重要條件之一。腫瘤細(xì)胞常位于血管周圍，而HAMBARDZUMYAN等[18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞主要存在于血管旁微環(huán)境，且微環(huán)境可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)和自我更新。本次實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤成球能力和CD133+細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明通過(guò)微環(huán)境的改變，可以改變髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的行為。

關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，TRUONG等[19]建立3D器官型微流體模型以模擬三維的血管微環(huán)境，將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在模型內(nèi)共同培養(yǎng)，可明顯增加膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的侵襲特性。本研究Transwell侵襲試驗(yàn)表明D341Med+HBMEC組穿膜細(xì)胞數(shù)較D341Med組明顯增加，體內(nèi)試驗(yàn)顯示D341Med+HBMEC組腫瘤體積明顯增大，證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的侵襲性，而且加強(qiáng)了髓母細(xì)胞瘤的致瘤性。

Notch信號(hào)通路是保守而重要的經(jīng)典通路之一。Notch受體有Notch1-4，配體有Jagged 1、 DLL4等，靶基因有Hes-1、Hey-2等。Notch信號(hào)系統(tǒng)可調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[20-21]，有研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可激活Notch信號(hào)促進(jìn)自我更新和侵襲性[22-23]。

圖3 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)Notch相關(guān)指標(biāo)(Noch 2、Jagged 1、Hes-1和Hey-2)mRNA(A)和蛋白水平(B)的影響 D341Med+HBMEC組與341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05

圖4 內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)Notch通路對(duì)腫瘤形態(tài)和體積的影響 D341Med+HBMEC組與341Med組相比，*P<0.05；D341Med+HBMEC組與D341Med+HBMEC+DAPT組相比，#P<0.05

免疫熒光染色顯示高水平表達(dá)Notch 1和Notch 2受體的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞附近，而內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Notch配體DLL4和Jagged 1，它們可通過(guò)細(xì)胞間相互接觸激活膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表面的Notch受體，促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新[17，24]。另外，內(nèi)皮細(xì)胞還可通過(guò)分泌一氧化氮激活Notch信號(hào)，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新和膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[25-26]，通過(guò)γ-分泌酶抑制劑(DAPT)可抑制Notch信號(hào)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新減少，同時(shí)減少了微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞[27-28]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與D341Med組相比，D341Med+HBMECs組提高了Noch 2、Jagded 1、Hes-1和Hey-2的mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)，證實(shí)HBMEC激活了髓母細(xì)胞瘤的Notch系統(tǒng)；反之，通過(guò)加入DAPT以阻斷Notch信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞減少(P<0.05)，伴隨Noch 2、Jagded 1、hes-1和hey-2的表達(dá)下降(P<0.05)，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)激活Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞形成。而Transwell侵襲試驗(yàn)顯示，D341Med+HBMEC+DAPT組與D341Med+HBMEC組相比，穿膜細(xì)胞減少(P<0.05)。體內(nèi)試驗(yàn)顯示前者比后者腫瘤體積明顯縮小，說(shuō)明通過(guò)抑制Notch信號(hào)，可減少血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞侵襲能力的影響。

本研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞和髓母細(xì)胞瘤共同培養(yǎng)可明顯增加髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的比例，同時(shí)增加腫瘤的侵襲能力，但在應(yīng)用Notch信號(hào)系統(tǒng)抑制劑后上述作用明顯下降，說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)激活Notch通路促進(jìn)髓母細(xì)胞瘤干細(xì)胞增殖、自我更新和侵襲能力。