付 嬈，張海洋，喬 鵬，梁曉艷，邢延富，宋延靜，李茹霞，李俊林，郭洪恩，王向譽(yù)

(1.山東省蠶業(yè)研究所，山東煙臺(tái) 264002；2.煙臺(tái)市福山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東煙臺(tái) 265500)

隨著淡水資源危機(jī)以及土壤鹽漬化問(wèn)題的加劇，探索微咸水或海水資源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用、充分利用鹽漬化土壤是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的新方向。中國(guó)的鹽堿地總面積達(dá)3630萬(wàn)hm2，其中，近100萬(wàn)hm2濱海鹽堿地是直接或間接受海水或海潮影響的地區(qū)，土壤含鹽量一般為0.6%～1.0%，高者達(dá)3%以上，鹽分組成以氯化物為主[1]。近十幾年來(lái)，鹽堿地改良利用技術(shù)不斷創(chuàng)新發(fā)展，主要集中于利用淡水洗鹽、暗管排鹽和修筑臺(tái)田等工程措施將土壤的含鹽量降低到作物能適應(yīng)的程度，或直接種植鹽生植物、耐鹽經(jīng)濟(jì)作物等[2]。加強(qiáng)耐鹽植物種質(zhì)資源的篩選與培育，對(duì)推動(dòng)鹽堿地的綠色高效利用有重要意義。要實(shí)現(xiàn)兼具經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的耐鹽植物新品種(品系)的培育，闡明植物對(duì)鹽堿地生境的生理生態(tài)響應(yīng)及分子調(diào)控機(jī)制是基礎(chǔ)亦是關(guān)鍵。

陳華等[20]將蒲公英作為耐海水蔬菜開(kāi)發(fā)的新成員，其集食用、藥用、保健和生態(tài)價(jià)值于一身。筆者前期的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)在NaCl和海水脅迫下，蒲公英葉片中的3種抗氧化酶SOD、POD和CAT活性迅速增強(qiáng)，本研究擬在此基礎(chǔ)上，以蒲公英葉片cDNA為模板，利用同源克隆的方法得到蒲公英TmoCu/ZnSOD、TmoAPX和TmoCAT基因，對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并測(cè)定NaCl單鹽和海水復(fù)合鹽脅迫下基因的表達(dá)情況，以期了解鹽脅迫下蒲公英抗氧化酶系統(tǒng)變化機(jī)理，為蒲公英耐鹽分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 幼苗培養(yǎng)及鹽脅迫處理

試驗(yàn)材料為煙臺(tái)本地采集的野生蒲公英種子，單鹽為200 mmol/L的NaCl，等Na+含量的海水(鹽質(zhì)量濃度16 g/L)為天然海水和蒸餾水配制，其中天然海水取自煙臺(tái)近海，鹽質(zhì)量濃度為33.33 g/L，蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)播種于花盆中，待幼苗長(zhǎng)至8～10片真葉時(shí)進(jìn)行鹽處理。對(duì)照組澆灌蒸餾水，單鹽處理組澆灌200 mmol/L的NaCl，復(fù)合鹽處理組澆灌鹽質(zhì)量濃度16 g/L的海水，分別設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

對(duì)照組、NaCl和海水脅迫處理組，分別處理0 h、3 h、6 h和12 h，采集長(zhǎng)勢(shì)基本一致的相同部位的葉片，且每一處理選用3株不同植株的葉片，液氮速凍，-80 ℃冰箱中保存。利用Trizol試劑(InvitrogenTM)進(jìn)行總RNA的提取，凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA的完整性，并用NanoDrop 2000C(Thermo Scientific)超微量分光光度計(jì)測(cè)定其 濃度。

1.3 抗氧化酶基因的克隆

由于蒲公英尚未有基因組數(shù)據(jù)，在植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)查找與其親緣關(guān)系相近且已有基因組數(shù)據(jù)的向日葵和萵苣3種抗氧化酶基因的cDNA和氨基酸序列，下載后與擬南芥、棉花和水稻相關(guān)基因的核酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，查找與其他物種保守性較高的基因，最終選取向日葵Cu/ZnSOD基因(GenBank登錄號(hào)XM_022153724)、CAT基因(GenBank登錄號(hào)XM_022141874)和萵苣APX基因(GenBank登錄號(hào)XM_023880576)的核酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為盡可能多地獲得蒲公英抗氧化酶基因的遺傳信息，正向和反向引物的設(shè)計(jì)分別從向日葵和萵苣相關(guān)基因的起始和終止密碼子開(kāi)始(表 1)。以蒲公英葉片cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 1 μL、前后引物(10 μmol/L)各0.75 μL、10×EasyPfu Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL、EasyPfu DNA Polymerase 0.5 μL和Nuclease-free water 14.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、切膠回收，膠回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體(TRANSGEN)連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。

1.4 抗氧化酶基因氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

蒲公英抗氧化酶基因的編碼區(qū)序列，經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行拼接，用Editseq預(yù)測(cè)基因氨基酸序列，通過(guò)在線軟件Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)和NCBI Conserved Domain分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。利用ClustalX2軟件將預(yù)測(cè)的氨基酸序列與NCBI下載的萵苣(LactucasativaLinn.)、向日葵(HelianthusannuusL.)、棉花(Gossypiumraimondii)、毛果楊(Populustrichocarpa)、葡萄(VitisviniferaL.)、番茄(Solanumlycopersicum)、大豆(GlycinemaxLinn. Merr.)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)、水稻(OryzasativaL.)和玉米(ZeamaysL.)相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 抗氧化酶基因的表達(dá)分析

以肌動(dòng)蛋白基因Actin為內(nèi)參基因[21]，檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組中抗氧化酶基因的表達(dá)情況。根據(jù)克隆得到的抗氧化酶基因編碼區(qū)序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表 1)，由北京六合華大基因科技有限公司合成。以蒲公英葉片cDNA為模板，利用TransStart Tip Green qPCR Super Mix試劑，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 0.5 μL、前后引物(10 μmol/L)各0.5 μL、2 ×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL和Nuclease-free water 8.5 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后采用2-ΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量[22]，ΔCt=Ct目的片段-Ct內(nèi)參基因。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英抗氧化酶基因克隆和生物信息學(xué) 分析

采用同源克隆的方法，從蒲公英葉片中克隆到3個(gè)抗氧化酶基因，分別命名為TmoCu/ZnSOD1、TmoAPX1和TmoCAT1(圖1)，其中TmoCu/ZnSOD1基因CDS序列全長(zhǎng)474 bp，編碼1個(gè)含157個(gè)氨基酸殘基的銅鋅超氧化物歧化酶和1個(gè)終止密碼子(圖2)；TmoAPX1基因CDS序列全長(zhǎng)852 bp，編碼1個(gè)含283個(gè)氨基酸殘基的L-抗壞血酸過(guò)氧化物酶和1個(gè)終止密碼子(圖3)；TmoCAT1基因CDS序列全長(zhǎng)1 479 bp，編碼1個(gè)含492個(gè)氨基酸殘基的過(guò)氧化氫酶和1個(gè)終止密碼子(圖4)。多序列比對(duì)結(jié)果表明TmoCu/ZnSOD1、TmoAPX1和TmoCAT1與來(lái)自其他植物的Cu/ZnSODs、APXs和CATs有相同的家族特征，包括高度保守結(jié)構(gòu)域(圖2、3和4)。

圖1 TmoCu/ZnSOD1、 TmoAPX1和 TmoCAT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification products of TmoCu/ZnSOD1, TmoAPX1 and TmoCAT1

圖2 TmoCu/ZnSOD1與其他植物Cu/ZnSODs氨基酸序列的比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of TmoCu/ZnSOD1 and amino acid sequence of Cu/ZnSODs from other plants

圖3 TmoAPX1與其他植物APXs氨基酸序列的比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of TmoAPX1 and amino acid sequence of APXs from other plants

將克隆得到的蒲公英3個(gè)抗氧化酶基因與其他11個(gè)物種的抗氧化酶基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，序列同源性見(jiàn)表2，結(jié)果表明，TmoCu/ZnSOD1與萵苣中的Cu/ZnSOD氨基酸同源性最高(93.63%)，其次為向日葵(84.71%)，然后是番茄(84.08%)、棉花(81.17%)，與其他物種氨基酸同源性小于80%。TmoAPX1與萵苣和向日葵APX氨基酸同源性均大于90%，與棉花、毛果楊、葡萄和番茄同源性均大于80%，與其他物種氨基酸同源性小于80%。TmoCAT1與其他11個(gè)物種的CAT氨基酸同源性均大于80%，與萵苣、向日葵和毛果楊同源性較高。

基于抗氧化酶基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明：TmoCu/ZnSOD1與同屬菊科的萵苣進(jìn)化關(guān)系最近，其次為菊科的向日葵、茄科的番茄(圖5-A)；TmoAPX1與同屬菊科的萵苣和向日葵的進(jìn)化關(guān)系最近，其次為單子葉植物水稻和玉米(圖5-B)；TmoCAT1與同屬菊科的萵苣和向日葵的進(jìn)化關(guān)系最近(圖5-C)。

圖4 TmoCAT1與其他植物CATs氨基酸序列的比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of TmoCAT1 and amino acid sequence of CATs from other plants

表2 蒲公英3種抗氧化酶與其他植物抗氧化酶基因氨基酸序列同源性比較Table 2 Comparison of amino acid sequence homology between three antioxidant enzymes of dandelion and other plants

2.2 鹽脅迫對(duì)蒲公英葉片抗氧化酶基因表達(dá)的影響

蒲公英抗氧化酶基因在NaCl和海水脅迫后的表達(dá)分析(圖6)顯示，對(duì)照組TmoCu/ZnSOD1、TmoAPX1和TmoCAT1的表達(dá)量均無(wú)顯著變化(P>0.05)，用200 mmol/L NaCl和鹽濃度16 g/L的海水處理后，TmoCu/ZnSOD1、TmoAPX1和TmoCAT1表達(dá)量均增加。NaCl處理3、6和12 h，TmoCu/ZnSOD1表達(dá)量相比0 h分別增加140.93%、263.41%和351.13%，且P值均小于0.05；海水處理3、6和12 h，TmoCu/ZnSOD1表達(dá)量相比0 h分別增加 570.97%、421.95%和220.96%，且P值均小于0.05(圖6-A)。NaCl處理3、6和12 h，TmoAPX1表達(dá)量相比0 h分別增加168.35%、103.35%和127.93%，且P值均小于0.05；海水處理3、6和12 h，TmoAPX1表達(dá)量相比0 h分別增加209.84%、71.89%和112.64%，且P值均小于0.05(圖6-B)。NaCl處理3、6和12 h，TmoCAT1表達(dá)量相比0 h分別增加 184.79%、123.66%和161.80%，且P值均小于0.05；海水處理3、6和12 h，TmoCAT1表達(dá)量相比0 h分別增加226.85%、157.27%和106.94%，且P值均小于0.05(圖6-C)。

3 結(jié)論與討論

鹽堿化是一個(gè)世界性的問(wèn)題，受鹽堿化影響的地區(qū)由于降雨少、灌溉系統(tǒng)差、鹽分入侵、水污染等環(huán)境因素而日益嚴(yán)重。植物鹽分脅迫耐受機(jī)制是非常復(fù)雜的現(xiàn)象，需要各種生理生化過(guò)程的協(xié)同作用和基因水平的綜合調(diào)控[23-24]。近年來(lái)，鹽生或甜土植物抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)已取得重大進(jìn)展，鹽脅迫下抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的變化依植物種類、脅迫程度而異。植物對(duì)逆境脅迫耐受能力的增加，常伴隨抗氧化酶基因表達(dá)量的上升。水稻中的抗氧化酶基因OsAPx8[25]、cCuZn-SOD2[26]和OsAPX7[27]在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，積極參與ROS的清除。鹽脅迫下植物抗氧化酶系統(tǒng)的變化機(jī)理也已有相關(guān)研究，一些研究結(jié)果表明抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的構(gòu)成和轉(zhuǎn)錄表達(dá)與其活性相關(guān)，Hu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，多年生黑麥草耐鹽品種中的APX活性高于鹽敏感品種，同時(shí)其抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)高于鹽敏感品種，APX基因表達(dá)水平與其酶活性正相關(guān)，進(jìn)而推測(cè)黑麥草的耐鹽性與抗氧化酶基因的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)相關(guān)。但也有研究表明，抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平與其酶活性水平的變化可能并不一致，Lopez等[29]研究表明，鹽脅迫下，蘿卜中APX活性增加但其基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并未增加；Hu等[30]在多年生黑麥草中的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下葉片POD和CAT酶活性降低，而POD和CAT基因的轉(zhuǎn)錄明顯升高。本研究結(jié)果顯示，鹽處理后蒲公英TmoCu/ZnSOD、TmoAPX和TmoCAT基因的表達(dá)量迅速增加，同時(shí)前期的試驗(yàn)結(jié)果顯示，蒲公英葉片中SOD、POD和CAT酶活性在鹽脅迫處理?xiàng)l件下與對(duì)照組相比明顯增加，證實(shí)抗氧化酶基因的表達(dá)水平與其酶活性正相關(guān)。但隨著鹽脅迫時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，基因表達(dá)量有所回落，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間受到較高濃度的鹽脅迫，過(guò)量的活性氧大量積累，對(duì)其細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生與清除失去平衡。此外，在前期的研究中筆者比較分析了NaCl單鹽和海水復(fù)合鹽脅迫下蒲公英葉片SOD、POD和CAT酶活性的差異，相較于NaCl單鹽脅迫，海水復(fù)合鹽脅迫下酶活性有所增加。因此，本研究基于基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平分析NaCl單鹽脅迫和海水復(fù)合鹽脅迫對(duì)蒲公英的影響，結(jié)果顯示，TmoCu/ZnSOD1表達(dá)量在海水復(fù)合鹽脅迫下表達(dá)量的增加速率顯著高于NaCl單鹽，TmoAPX和TmoCAT基因表達(dá)量的增加速率和量在NaCl單鹽和海水復(fù)合鹽脅迫中差異不顯著，表明復(fù)合鹽誘導(dǎo)的酶活性增加也可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

圖5 蒲公英 TmoCu/ZnSOD1(A)、 TmoAPX1(B)和 TmoCAT1(C)與其他植物抗氧化酶的進(jìn)化分析Fig.5 Evolutionary analysis of TmoCu/ZnSOD1 (A), TmoAPX1(B) and TmoCAT1(C) in dandelion and other plants

柱形上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)